Stratégies de clonage des anticorps monoclonaux

par Sosthène Essono

Thèse de doctorat en Stratégies d'exploitation des fonctions biologiques

Sous la direction de Christophe Créminon.

Soutenue en 2004

à Compiègne .


  • Résumé

    Le clonage des ADN complémentaires codant pour les régions variables des immunoglobulines est une étape incontournable pour la construction d'anticorps recombinants dont l'utilisation dans les domaines biotechnologiques et thérapeutiques est en constante progression. La particularité des "gènes" codant les chaînes lourdes et légères est qu'ils résultent d'un réarrangement de différentes régions d'ADN spécifique d'un lymphocyte B. La grande diversité générée par un grand nombre de gènes V, des étapes de recombinaison et de mutations ponctuelles induitent lors du processus de différenciation du lymphocyte B explique la difficulté de cloner ces ADNc par une étape de RT-PCR avec les amorces, déjà décrites, localisées dans les FRI et FR4. Ce manuscrit décrit les différentes stratégies que nous avons utilisé pour pouvoir affirmer que les séquences en acides aminés déduites des ADNc obtenus sont bien identiques à celles de l'anticorps monoclonal. La première approche, consistant à amplifier et exprimer directement (sous forme de scFv) les régions variables par RT-PCR à l'aide d'un mélange d'amorces s'hybridant dans les FRI et FR4, s'est révélée être un échec. Nous avons ensuite analysé systématiquement les séquences des régions variables. Nous avons constaté que les amorces s'hybridant dans le FRI et FR4 imposaient leur propres aminoacides. Afin de lever ces ambiguités dans la composition en acides aminés, nous avons analysé la séquence de l'anticorps monoclonal en générant une empreinte peptidique trypsique par spectre de masse. Finalement, nous avons combiné, pour obtenir des séquences " certifiées" des régions variables, une amplification des ADNc par RACE-PCR et une validation par une approche protéomique associé à la reconnaissance par le scFv de l'antigène.

  • Titre traduit

    Cloning strategies formonoclonal antibodies


  • Résumé

    The efficient cloning of the cDNA encoding variable regions of Immunoglobulins is the first hurdle that must be overcome if we are to develop 1 recombinant antibodies of biological and therapeutic relevance. Moreover, characteristic of the domains coding the heavy and light chains is that they result froID a rearrangement of various genes (V -D-J-C) of specific DNA of B-cell. Besides, diversity generated by the large number of V genes, Like recombination and specifics change induced during B-cell maturation and differentiation process, highlights the difficulty of rcloning these cDNA by a RT-PCR with described family specific primers. This manuscript describes Jour strategy, used to confirm that the 1 ami no acid sequence deduced froID hybridoma cDNA, are identical to those of monoclonal antibody investigated. The first approach consisting of direct amplification of VL and VH chains by RT-PCR methodology and expression of the corresponding single-chain antibody (ScFv). This i approach proved to by slow and tedious, hindered further by the observation that the FRl and FR4 primers imposed their own amino acids. Ln Jaddition the aberrantly transcribed V-genes (from the fusion partner) could be amplified by degenerated family specific primers in any given ,hybridoma for each V-gene locus, in addition to the functionally rearranged allele imposing additional technical difficulties. That why, it's was 1 necessary to identify the correct rearranged clones. Ln order to rai se these additional ambiguities, we amplified the sequences by RACE-PCR, those,sequences were then analyzed systematically, by generating a tryptic peptide map by MALDI-TOF mass spectrometer and peptide "fingerprint" or protein databases searching for characterization of the corresponding sequence. Finally, we combined amplification of cDNA by RACE-PCR and validation by a proteomic approach associated with functional recognition by ScFv of the antigen to obtain "certified" sequences of mobilized variable genes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (170 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 132 réf.

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  • Bibliothèque : Université de Technologie de Compiègne. Service Commun de la Documentation.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2004 ESS 1517
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