Ingéniérie de la transcétolase de Saccharomyces cerevisiae et mise au point d'un test de criblage fluorimétrique pour la synthèse enzymatique d'analogues de monosaccharides

par Aurélie Sevestre

Thèse de doctorat en Chimie organique biologique

Sous la direction de Laurence Hecquet.

Soutenue en 2004

à Clermont-Ferrand 2 .

  • Titre traduit

    Engineering of the transketolase of Saccharomyces cerevisiae and perfecting of a fluorogenic screening test for the enzymatic synthesis of new monosaccharides


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  • Résumé

    La transcétolase (TK) permet de synthétiser des cétoses D-thréo par formation stéréospécifique d'une liaison C-C. L'objectif de ces travaux vise à modifier la spécificité de substrat de la TK de Saccharomyces cerevisiae par évolution dirigée pour accéder à d'autres monosaccharides : des aldoses D-thréo ou des cétoses L-érythro. La stratégie consiste à créer une bibliothèque d'enzymes mutées et à identifier celles qui présentent les propriétés désirées. Nous avons développé un test de criblage fluorimétrique in vitro et in vivo en présence de substrats fluorogéniques que nous avons synthétisés. Pour modifier sa spécificité de substrat, la séquence codante du gène TKL1 a été mutée par PCR infidèle. Ces séquences ont été clonées dans un plasmide pour les TK avec une étiquette "six histidines " (TK 6His). Après transformation, une bibliothèque de 3000 levures a été obtenue et criblée. Aucune d'entre elles ne présente les propriétés recherchées. Certains aspects sont à confirmer comme la spécificité du test et l'activité de la TK6His

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Informations

  • Détails : 1 vol. (274 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 265-274

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  • Bibliothèque : Bibliothèque Clermont Université (Aubière). Section Sciences et Techniques.
  • Disponible pour le PEB
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