Approches moléculaires du mode d'action des opioi͏̈des : Etude structurale et fonctionnelle du récepteur humain des opioi͏̈des de type mu surexprimé en cellules d'insecte

par Bénédicte Perret

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Franc Pattus.

Soutenue en 2003

à Strasbourg 1 .


  • Résumé

    La prise en charge et le soulagement de la douleur représentent une nécessité médicale majeure. La morphine demeure l'antalgique le plus puissant utilisé en clinique mais elle comporte des effets indésirables. Elle agit principalement sur le récepteur des opioi͏̈des de type mu, un récepteur appartenant à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G. Comprendre les interactions ligand-récepteur et les modifications conformationnelles qui en résultent constitue une étape indispensable à l'interprétation de l'action des opioi͏̈des au niveau moléculaire. De plus, la conception de molécules à effet thérapeutique basée sur la structure des récepteurs apparaît de plus en plus comme un outil précieux en chimie médicinale. Dans le cas des opioi͏̈des, cette stratégie n'est pas appplicable puisque aucune structure cristallographique de ces récepteurs n'est disponible. Or, ces récepteurs sont naturellement très faiblement exprimés. Des systèmes de surexpression appropriés sont donc requis pour obtenir d'importantes quantités de protéine pure et active. Ce travail a débuté par les essais de solubilisation et purification du récepteur humain des opioi͏̈des de type mu (hMOR) surexprimé dans les cellules Sf9 infectées par un baculovirus recombinant. Face aux difficultés rencontrées, un nouveau système d'expression inductible basé sur l'obtention de lignées stables dans des cellules Schneider S2 de Drosophila melanogaster a été mis en place. De manière innovante, le récepteur hMOR a été couplé à l'EGFP afin de permettre le suivi, la localisation, la quantification de manière directe et le développement d'un protocole de purification. Le récepteur produit a été caractérisé d'un point de vue biochimique et pharmacologique et sa purification a été entreprise. En parallèle, nous avons souhaité adapter la technique de mesure de la capacité de liaison du récepteur EGFPhMOR par transfert d'énergie de résonance de fluorescence avec différents ligands opioi͏̈des rendus fluorescents.


  • Résumé

    Pain management and treatment represent a major unmet medical challenge. Morphine remains the most potent painkiller used clinically, despite secondary side effects. It principally acts on the mu opioid receptor that belongs to the superfamily of the G-Protein-Coupled receptors. Interpretation of the opioid mode of action at the molecular level needs that we understand how the receptor and ligands interact with each other and what are the associated conformational changes. Moreover, the integration of structure-based methods, virtual screening, and combinatorial chemistry can provide the basis for more efficient drug design. In the case of opioids, this strategy is not applicable because these receptors are not yet amenable to structure based drug design due to the lack of three-dimensional structures. These receptors are endogenously poorly expressed so appropriate overexpression systems are required to obtain the large amounts needed for crystallization. This work began with solubilization and purification trials of the human mu opioid receptor (hMOR) overexpressed in baculovirus-infected Sf9 cells. Because difficulties we encountered, a new system of expression based on stable cell lines and on an inducible expression in Drosophila melanogaster Schneider S2 cells was developed. In an innovating way, the receptor was fused to the EGFP to follow, localize, directly quantify and develop a purification protocol. The produced receptor EGFPhMOR was biochemically and pharmacologically characterized and we began the purification process. In parallel, we wished to adapt the measurement of the binding capacity of the receptor based on the fluorescence resonance energy transfer between the EGFP fused to the receptor and opioid ligands wa made fluorescent.

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Informations

  • Détails : 225 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 203-225

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service des bibliothèques. Bibliothèque L'Alinéa.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2003;4318
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