Cloning and characterisation of anti-Scl-70 autoantibodies for the diagnosis of systemic sclerosis

par Malte Weber

Thèse de doctorat en Sciences du vivant

Sous la direction de Etienne Weiss et de Alfred Engel.

Soutenue en 2003

à Strasbourg 1 .


  • Résumé

    La sclérose systémique (SSc) est une maladie chronique rare, caractérisée par l'apparition de fibroses associées à l'inflammation de divers organes. La progression de la maladie est généralement accompagnée de la synthèse d'anticorps dirigés contre des antigènes du soi, principalement d'origine nucléaire. L'anti-Scl-70 est un des trois auto-anticorps majeurs et présente une signification clinique. Sa détection fait partie du diagnostic de la SSc et des sérums de référence sont utilisés pour l'étalonnage des données. Pourtant ces sérums ne remplissent pas les critères nécessaires pour une application internationale. Par conséquent, il existe un grand besoin de standardisation du matériel de référence afin d'assurer une bonne comparabilité des données pour le test de détection d'anticorps anti-Scl-70. Dans cette perspective, nous avons tenté de produire un antigène de haute qualité par la génération de lignées cellulaires 293 exprimant la topoisomérase I de manière stable. Par la suite, nous avons développé une nouvelle stratégie pour l'isolement de fragment d'anticorps à partir de petits échantillons de sang, en combinant la culture de cellules B humaines et la technologie du phage display. Nous avons ainsi identifié 5 scFv spécifiques pour la topo I. Ceux-ci nous ont permis l'étude d'antigènicité de différentes sources d'antigène. Après transformation de deux scFv en anticorps recombinants totaux, la spécificité pour l'antigène n'a pas été conservée. Par conséquent, le transfert de régions variables dans un contexte d'anticorps recombinants humains totaux n'a pas donné lieu à une production d'un standard de référence pour le diagnostic de la sclérose systémique. Cependant, l'utilisation d'un standard constitué du produit de fusion d'un scFv avec le fragment constant humain (scFv-Fc) serait envisageable.

  • Titre traduit

    Clonage et caractérisation de fragments d'auto-anticorps humains anti-Scl-70 pour le diagnostic précis de la sclérose systémique


  • Résumé

    Systemic sclerosis (SSc) is a rare autoimmune disease characterised by inflammation and fibrosis of many organs. One of three major autoantibodies is the anti-Scl-70 autoantibody that recognises the nuclear enzyme topoisomerase I (topo I). This autoantibody is diagnostic and clinical significance because it is present in up to 30% of SSc patients and it's appearance is linked to pulmonary fibrosis. One part of the diagnosis of SSc is made by autoantibody assays for which anti-Scl-70 reference sera are used as internal standards. These reference sera are available only in small quantities and are of highly variable autoantibody content which makes them unsuitable for international use. In order to guarantee international assay comparability it is necessary to develop standards of well-defined specificity and standard composition. With the aim of generating such a standard for anti-Scl-70 antibody assays, we first attempted to provide high quality antigen for antibody isolation by stably expressing human topo I in CHO and 293 cells. Subsequently, we developed a new strategy for successful isolation of antibody fragments (scFv) from small patient blood samples by combining human B cell culture and phage display. We isolated 5 scFvs that are highly specific for topo I. These scFvs are heterogeneous in terms of sequence diversity, affinities, and antigen recognition. Our findings underline that the process of autoantibody generation in SSc is highly complex and that antigen source and quality determines the efficiency of autoantibody detection. In addition, the suitability as standard of two of these scFvs converted into full length antibodies was assessed. These full-length antibodies did not retain antigen specificity and could not been used as a standard for the diagnostic of SSc. However, the identified scFvs might be used as a standard in form of a scFv-Fc fusion.

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Informations

  • Détails : 141 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 123-131

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service des bibliothèques. Bibliothèque L'Alinéa.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2003;4321
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