Production de virus pseudotypes VSV/VHC : Etude de la fusion du VHC avec les cellules hôtes

par Audrey Codran

Thèse de doctorat en Sciences

Sous la direction de Jean-Pierre Martin.

Soutenue en 2003

à Strasbourg 1 .


  • Résumé

    En raison de l'absence de système de culture cellulaire capable de propager efficacement le virus de l'hépatite C, peu de données sont disponibles concernant les phases précoces de l'infection. Afin d'étudier la fusion et la pénétration du VHC dans la cellule hôte, nous avons choisi de fabriquer des virus pseudotypes VSV/VHC destinés à mimer l'enveloppe du VHC dans les phases précoces de l'infection. Dans un premier temps, les glycoprotéines d'enveloppe du VHC (E1 et E2) sont modifiées pour être localisées à la membrane plasmique, site de bourgeonnement du VSV. Pour cela, les ectodomaines de E1 (jusqu'à l'acide aminé 311) et de E2 (jusqu'à l'acide aminé 661) sont fusionnés aux domaines transmembranaire et cytoplasmique de la glycoprotéine G du VSV. La protéine de fusion E1-TmG est également fusionnée à l'EGFP afin de faciliter sa détection. Les protéines de fusion EGFP-E1-TmG et E2-TmG sont produites dans la cellule grâce à deux adénovirus recombinants non réplicatifs. Pour produire les virus pseudotypes, les cellules sont tout d'abord infectées par ces deux adénovirus recombinants à 37 ʿC, puis par le VSVtsO45 à 40,5 ʿC, température à laquelle la glycoprotéine G mutée du VSV est retenue au niveau du réticulum endoplasmique. Les particules ainsi produites sont constituées d'une enveloppe contenant les glycoprotéines E1 et E2 modifiées et leur génome est celui du VSVtsO45. Par conséquent, l'infection de cellules par les pseudotypes à 33 ʿC (température permissive de la mutation thermosensible) permet la production de VSVtsO45. Dans un deuxième temps, nous nous intéressons aux mécanismes utilisés par le VHC pour pénétrer dans la cellule. Nous avons ainsi pu déterminer que la fusion des membranes virale et cellulaire se déroulait à pH acide et qu'elle avait lieu dans l'endosome. Finalement, nos résultats indiquent que les pseudotypes pénètreraient dans la cellule majoritairement par endocytose clathrine-dépendante

  • Titre traduit

    Generation of VSV/HCV pseudotyped particles, study of hepatitis C virus fusion with host cells


  • Résumé

    Due to the lack of cell culture system to propagate efficiently HCV, only few data are available concerning the early stages of HCV infection. In order to study HCV fusion and penetration into host cells, we have chosen to generate VSV/HCV pseudotyped viruses to mimic HCV envelope during the early stages of infection. First, E1 and E2 HCV glycoproteins are modified to be localized at the plasma membrane where VSV budding occurs. Thus, E1 (amino acid 311) and E2 (amino acid 661) ectodomains are fused to the transmembrane domain and the cytoplasmic tail of VSV G glycoprotein. Chimeric E1-TmG is also fused to EGFP to allow easy detection of this protein. Chimeric E1 and E2 are expressed in cells using non replicative recombinant adenoviruses. To produce pseudotypes, cells are first infected by both recombinant adenoviruses at 37 ʿC, and then super-infected by VSVtsO45 at 40. 5 ʿC. At this non-permissive temperature, the mutated VSV G glycoprotein is retained in the endoplasmic reticulum. Particles resulting from this triple infection are enveloped by modified E1 and E2 but their genome is still VSVtsO45. Therefore, infection with pseudotypes at 33 ʿC (permissive temperature for the mutation) will lead to production of VSVtsO45 virions. In a second step, we are interested in mechanisms involved in HCV penetration into the host cell. Pseudotypes are used to determine optimal pH required for cellular and viral membranes fusion. The use of such a tool has allowed to investigate and to understand part of the endocytic pathway implicated in early stages of HCV infection. Our results indicate that pseudotypes enter host cells via a pH-dependant route, that fusion of viral and cellular membranes occurs in the endosome, and that clathrin is involved in this mechanism.

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Informations

  • Détails : 145 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 124-145

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2003;4273
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