Analyse quantitative des interactions moléculaires au cours de la transfection par des complexes ADN/polyéthylèneimines

par Jean-Pierre Clamme

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Yves Mély.

Soutenue en 2003

à l'Université Louis Pasteur (Strasbourg) .


  • Résumé

    Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de concevoir l'utilisation de l'ADN en temps qu'agent thérapeutique pour le traitement de maladies génétiques héréditaires (mucoviscidose,myopathie) ou acquises (cancer). Le succès de la thérapie génique repose sur la mise au point de vecteurs capables de transférer le gène d'intérêt thérapeutique au sein de la cellule. Dans ce cadre nous avons étudié la formation, la composition et le devenir cellulaire de complexes entre l'ADN et l'un des vecteurs synthétiques de transfert de gène le plus prometteurs: la polyéthylèneimine. Dans un premier temps, les études menées par microscopie confocale ont permis d'identifier les étapes limitantes de la transfection des cellules L929 par les complexes ADN/PEI. En effet, les marquages de l'ADN par le YOYO-1, du PEI par la Rhodamine et l'utilisation d'une sonde de suivi de l'endocytose le FM4-64, ont permis de montrer qu'après internalisation par endocytose en phase fluide, les complexes étaient majoritairement retenus dans les endosomes tardifs autour du noyau réduisant ainsi le passage de l'ADN vers ce dernier et limitant de ce fait l'efficacité de transfection du PEI. Dans un deuxième temps, la mise en place d'une plate-forme de spectroscopie à corrélation de fluorescence par excitation biphotonique, nous a permis de suivre la formation et la dissociation des complexes in vitro ainsi que d'en caractériser la composition. Ainsi, nous avons montré que les complexes contenaient en moyenne 3 plasmides et que lors de leur formation 85% du PEI restait libre en solution. Ce dernier point est susceptible d'être à l'origine de la toxicité observée lors de la transfection des cellules L929. Par ailleurs, des études de FCS en milieu cellulaire ont permis de mettre en évidence la présence de PEI libre dans l'ensemble des compartiments cellulaires et une importante interaction entre le PEI les constituants intracellulaires.


  • Résumé

    Progress in molecular biology made it possible to use DNA molecules as therapeutic agents for treatment of cancer or genetic diseases. The success of gene therapy depends on the development of vectors able to transfer therapeutic genes into the cell. Within this framework, we studied the formation, the composition and the cellular fate of complexes between DNA and one of the most promising non viral gene delivery vectors: polyethylenimine. The first part of this work allowed us to determine by confocal microscopy, the limiting steps of L929 cell transfection by DNA/PEI complexes. Indeed, using YOYO-1 labelled DNA, Rhodamine labelled PEI and the endocytosis marker FM4-64, we showed that after internalisation through the fluid phase endocytosis pathway, the complexes were mainly retained in the late endosomes around the nucleus. The limited release of the complexes from the endosome prevents DNA migration to the nucleus and thus reduced the transfection efficiency of PEI/DNA complexes. In the second part of the work, a two photon excitation fluorescence correlation spectroscopy setup has been developed to follow the in vitro formation and dissociation of DNA/PEI complexes and determine their composition. Thus, we showed that the complexes contained an average of 3 plasmides per complex and that after their formation 85% of the PEI remained free in solution. This high concentration of free PEI, probably explains the cytotoxicity observed during L929 transfection. In addition, intracellular FCS studies showed the presence of free PEI molecules in all cells compartments and a strong interaction between PEI and intracellular components.

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Informations

  • Détails : 186 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 129-146

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service des bibliothèques. Bibliothèque L'Alinéa.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2003;4251
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