Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des lymphocytes T contenus dans le liquide de bulles au cours de syndrome de Lyell

par Amal Nassif

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Jean-Claude Roujeau.

Soutenue en 2003

à Paris 12 .

mots clés

• Lyell, Syndrome de
• Toxicologie cellulaire
• Allergie aux médicaments
• Lymphocytes T

Résumé

Le syndrome de Lyell appelé aussi nécrolyse épidermique toxique (NET) est une réaction médicamenteuse caractérisée par un décollement de l’épiderme avec formation de bulles et érosion des muqueuses. Cette destruction massive est due à un mécanisme d’apoptose des kératinocytes, les médicaments les plus souvent responsables sont les sulfamides anti-bactériens, les anti-convulsivants et les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Des études préalables ont montré la présence prédominante des lymphocytes CD8+ activés dans le liquide de bulles chez des patients atteints de NET. Notre objectif a été de caractériser phénotypiquement et fonctionnellement cette population lymphocytaire. L’analyse phénotypique des cellules présentes dans les bulles a montré un phénotype homogène de lymphocytes T cytotoxiques. Ainsi la sous-population lymphocytaire CD8, exprime un récepteur T de type alpha-béta, des molécules d’activation HLA-DR et CLA (cutaneous associated leucocytes antigene) permettant le « homing » cutané. De plus ces lymphocytes expriment particulièrement le marqueur des cellules « naturall killer » CD56. L’étude fonctionnelle a montré que ces cellules présentaient une activité cytotoxique sans activation préalable, médiée par leur récepteur. Nous avons également démontré la présence de lymphocytes T spécifiques au médicament induisant la NET. Cette cytotoxicité spécifique est restreinte par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I. La cytotoxicité des lymphocytes spécifiques au médicament a également été observée sur des kératinocytes autologues cultivés à partir de follicules pileux. Cette apoptose est médiée principalement par la voie perforine/granzynie. Ainsi elle est abolit un inhibiteur de cette voie la concanamycine A (CMA), mais pas par un monoclonal anti-Fas (CD95) ou par un monoclonal anti-TRAIL. De plus les lymphocytes T (les bulles contiennent des granules qui sont marqués positivement avec un anti-granzyme B. Le liquide de bulles n’induit pas d’apoptose sur- les kératinocytes autologues. En revanche il les stimule en induisant une surexpression des molécules de classe I, une induction de l’expression des molécules HLA de classe II et des molécules d’adhésion CD54/ICAM1 a leur surface. L’ensemble de ces résultats confirme le rôle essentiel d’une cytotoxicité spécifique du médicament dans la nécrolyse épidermique toxique, restreinte aux molécules MHC de classe I et médiée par la voie perforine /granzyme.

Titre traduit

Characterization and fonction of T lymphocytes in skin lesions of patients with toxic epidermal necrolysis

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Résumé

Toxic Epidermal Necrolysts (TEN) are very rare but extremcly severe adverse reactions to medications, characterized by widespread apoptosis of keratinocytes with more or Iess extensive blistering of the epidermis. To further evaluate the phenotype, cytokine production ancl functions of lymphocytes present in the blisters of patients with TEN. In a first study (paper I) we reported the presence in the blister fluid ofdiseased skin in one patient suffering from sulfamethoxazole tnduced TEN, of CD8 cytotoxic T-lymphocytes (CTL). Like classical CTL they kiiled autologous lymphocytes in a drug specific, ciass I restrtcted and perforin/granzyme mcdiated pathway, without any ex vivo re-stimulation. In a second study (paper 2) we extended our initial findings to 6 patients. In ail 6 cases blister lymphocytes werc cytotoxic after activation of their TCR by a CD3 monoclonal antibody. A drug specific cytotoxicity vas observed in 4 cases (3 related to cotrimoxazole and I to carbamazepine) towards autologous or MHC-class I matched EBV transformed lymphocytes. We also demonstrated that blister cells killed autologous keratinocytes in the prescnce of drug. Blister cells showed a strong immunoreaetivity for granzyme B and the cytotoxtcity was abohshed by EGTA, but not by anti-Fas/CD95, suggesting perforin/granzyme rnediated ktlltng. In a third study (paper 3) We investigated whether the cytokines present in the blister fluid originated from local T-lymphocytes and may play a role in the propagation of keratinocyte apoptosis. IFNy, TNFalpha, SFasL were present in much highcr concentration in the blister fluids of 13 TEN patients than in control fluids. RT-PCR and FACS studies indicated that oniy IFN-y was produced by mononuclear cells present in the fluid, suggesttng that other cytokines (TNFalpha, sFasL, but also IL-10 and IL18) rather originated from activated keratinocytes. Keratinocytes cultured from one patient were indeed activated by incubation with autologous blister fluid but did not undergo apoptosis. The Th1 profile of T-lymphocyte activation found in the blister fluid ofpatients with TEN is consistent with a key role for drug specific CTL as previously reported, the activation ofkeratinocyte by JFN-y making them sensitive to cell-mediated cytolysis. We did not find evidence that other cytokincs played a direct role in “epidernic” apoptosis ofkeratinocytes. These results strongly suggest that drug-specific, MHC class I restricted, perforin/granzyme mediated cytotoxicity is the main effector mechanism of TEN. These results provide a rationale for therapeutic interventions targeting activated CTL.