Etude de l'empreinte chromosomique au locus sexuel mat1 chez la levure Schizosaccharomyces pombe

par Atanas Kaykov

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Benoit Arcangioli.

Soutenue en 2003

à Paris 11 .


  • Résumé

    L'empreinte chromosomique cartographiée au locus mat1contrôle le changement de type sexuel chez la levure Schizosaccharomyces pombe. La nature moléculaire de l'empreinte est sujet à polémique: cassure simple brin (CSB) de l'ADN ou modification de l'ADN sensible à la soude qui pourrait être un ARN. Nous avons ligaturé l'empreinte avec la ligase d'E. Coli, reformant ainsi la séquence d'ADN parentale, suggérant fortement que l'empreinte est une CSB sans perte de nucléotide. La ligature complète nécessite un traitement par la polynucléotide kinase. Nous avons montré que les extrémités de la CSB sont 3'-OH et 5'-OH. La CSB est indépendante de la séquence, mais spécifique du site. Plusieurs éléments de séquence, nécessaires à la formation ou à la stabilité de la CSB ont été identifiés. Un des éléments est essentiel pour la pause de la fourche de réplication à proximité de mat1 et interagit in vivo avec Swi1p. Un autre élément est essentiel pour maintenir la CSB lors de la progression dans le cycle cellulaire. Nous avons montré que l'ADN polymérase du brin continu synthétise l'ADN jusqu'à l'extrémité de la CSB, formant un intermédiaire bout franc transitoire, capable d'initier le changement de type sexuel. Afin d'obtenir un système inductible pour le changement de type sexuel nous avons introduit un promoteur répressible par la thiamine à proximité de mat1. En utilisant ce système nous avons obtenu une population homogène de cellules sans CSB présentant un type sexuel stable. Nous avons montré que la CSB est formée pendant la première phase S, lorsque les intermédiaires de réplication apparaissent à mat1. La pause de la fourche de réplication à mat1 est simultanée à la formation de la CSB. Swi1p se fixe fortement sur le site de pause pendant la réplication. Les intermédiaires de conversion génique apparaissent une génération après la formation de la CSB. Ce système a permis de disséquer moléculairement les différentes étapes du changement de type sexuel chez S. Pombe.


  • Résumé

    A strand-specific imprint located at the mating-type (mat1) locus, controls mating-type switching in the yeast Schizosaccharomyces pombe. However, the molecular nature of the imprint had remained unclear and it was proposed to be a strand-specific DNA break (SSB) or a strand-specific, alkali labile DNA modification due to an RNA left behind after incomplete Okazaki fragment processing. In the present study, we showed that the imprint could be ligated by the E. Coli DNA ligase to reform the parental DNA sequence, demonstrating that the imprint is a single stranded break (SSB), without a missing nucleotide. However, full ligation required the T4 polynucleotide kinase. We showed that the ends of the SSB are 3'-OH and 5'-OH. Mutation analysis of the SSB showed that the break is site but not sequence specific. Several new elements, required for SSB formation and stability, were identified. One of these elements was essential for a replication fort pause next to mat1 and interacted in vivo with the Swi1p. A second element was essential for maintaining the SSB during the cell cycle progression. We showed, that the leading strand DNA polymerase synthesized DNA to the edge of the SSB and formed a transitory blunt ended recombination intermediate, able to initiate mating type switching. We designed an inducible system for regulating mating-type switching by introducing a thiamine repressible promoter upstream of the mat1 locus. We were able to isolate homogenous population of cells that have not yet suffered a SSB or switched their mating type. We showed that the SSB was formed during the first S phase, when replication intermediates appeared at mat1. The replication fork pause and the SSB occurred simultaneously. During replication Swi1p bound strongly to the replication pause site. Intermediates of gene conversion were detected one generation after the SSB was formed. Thus, we have been able to dissect in molecular terms the genetic pedigree of the fission yeast.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 129 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.115-124

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)293
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.