De la biodégradation à la conception d'un bio-capteur : exemple du 3,5-dinitrotrifluorométhylbenzène

From the biodegradation to the conception of a biosensor : exemple of the 3,5-dinitrotrifluoromethylbenzen

• Auteur / Autrice : Philippe Chaignon
• Direction : Jean-Yves Lallemand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Photochimie

Nitroréductase

Purification de protéines

Clonage

Résumé

Le 3,5-dinitrotrifluorométhylbenzène 3,5-DNBTF est un composé utilisé par le CEA. Sa détection spécifique constitue une priorité sur les plans industriel et environnemental. Dans cette perspective, nous avons étudié la conception d'un biocapteur spécifique de ce composé. Nous avons tout d'abord mis au point des méthodes d'analyse du 3,5-DNBTF et de ses dérivés en solution. Étant donné la très faible solubilité dans l'eau du composé étudié, nous avons été amené à mettre au point une méthode HPLC couplé à la spectrométrie de masse pour identifier les dérivés et métabolites du 3,5-DNBTF. Afin d'orienter le choix des réactions enzymatiques susceptibles d'affecter le 3,5-DNBTF, nous avons exploré sa réactivité chimique. Seuls les groupements nitro se sont avérés réactifs, et conduisent par réduction au 3,5-diaminotrifluorométhylbenzene (3,5-DABTF). Cette molécule est le siège d'une réactivité photochimique originale. En effet, l'irradiation à 300nm du 3,5-DABTF dans l'eau conduit à la formation de l'acide 3,5-diaminobenzoi͏̈que, mais également à la formation de différents polymères, qui se forment grâce à des liaisons amides entre les amines et les intermédiaires de défluorination. L'étude de la dégradation microbiologique du 3,5-DNBTF a permis la sélection d'une souche de Bacillus (Bacillus LMA), seule capable de réduire les deux groupements nitro du 3,5-DNBTF avec une grande efficacité. La purification, couplée à la caractérisation par spectrométrie de masse, a permis d'identifier une nitroréductase de Bacillus subtilis. Celle-ci a été clonée et sur-exprimée chez E. Coli avec succès, permettant ainsi un accès facile à des quantités importantes de protéine active. La double nitro-réduction du 3,5-DNBTF, catalysée par un microorganisme entier ou par la nitroréductase purifiée, a été couplée à la transformation photochimique de la diamine correspondante. Ceci est à la base de la conception du biocapteur. Plusieurs moyens de détection ont été évalués, la formation du 3,5-DABA et la possibilité d'y associer une émission de fluorescence, la chute du pH au cours de la réaction, la production d'ions fluorure ou la coloration de la solution après irradiation. L'évaluation d'un prototype expérimental a été engagée.

The 3,5-dinitrotrifluoromethylbenzene (3,5-DNBTF) is currently evaluated by the (Commissariat a l'Energie Atomique). The challenge was the conception of a specific biosensor, based on enzymatic or microbial interactions. This will help monitoring of the compound for either environmental protection and security. Our first investigations were focused on the analytical methods for the detection of 3,5-DNBTF metabolites and derivatives in solution. Taken into account thee weak solubility of these molecules in water, we used a sensitive chromatographic HPLC technique coupled to mass spectrometry on APCI ionization, to assign the structure of newly observed compounds. We first investigate the chemical reactivity of 3,5-DNBTF. Only nitro substituants can be transformed to their respective diamino derivatives through catalytic hydrogenation. This molecule give rise to original photochemical reactivity. Indeed, the photo-irradiation at 310nm of the 3,5-DABTF in water lead to 3,5-diaminobenzoi͏̈c acid, as well as various polymers diriving from the interaction between 3,5-DABTF and some defluorination intermediates. A screnning was conducted on the biodegradation of 3,5-DNBTF, that allows the selection of a bacterial strain of Bacillus (Bacillus LMA), that was the solely strain to reduce both nitro groups of the 3,5-DNBTF with high efficiency. The purification of the nitroréductase involved in this reaction was investigated by classical chromatographic method, as well as an affinity chromatography process. This latter was based on a specific matrice coupled with a substrate analog, 3,5-dinitrobenzoic acid (3,5-DNBA). Mass spectrometry of the protein spots lead to the identification of a putative nitroreductase from Bacillus subtilis168. The corresponding gene was cloned and has been over-expressed in E. Coli successfully. The presence of a His-tag on the protein lead to a large quantities of purified active protein. The total nitro-reduction of 3,5-DNBTF, catalyzed by a whole microorganism or by the purified nitroreductase, has been coupled to the photochemical transformation of the corresponding diamine. This is the basis of our biosensor. The detection was oriented against Several parameters: the formation of the 3,5-DABA, that could be fluorescent under particular conditions, the decrease in pH during the reaction, the production of fluoride ions and the dark colour associated to particular, polymers formed during irradiation. Last phases in biosensor construction are under study.