Topoisomérase II : le modèle de physarum polycephalum

par Yannick Hugodot

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Biologie moléculaire de la cellule

Sous la direction de Michel Duguet.

Soutenue en 2003

à Paris 11 .


  • Résumé

    Les ADN-topoisomérases de type II sont des enzymes essentielles, capables de modifier la topologie de l'ADN en coupant transitoirement la double hélice, et susceptibles d'intervenir dans la plupart des processus de lecture ou de copie de l'information génétique. Toutefois, si leurs propriétés catalytiques sont bien caractérisées in vitro, leur activité et leur mode de régulation in vivo restent à éclaircir. Afin de mieux comprendre le rôle de ces enzymes au cours du cycle, cellulaire, nous avons choisi Physarum polycephalum, un organisme eucaryote capable de former une cellule syncitiale géante dont les millions de noyaux sont naturellement synchrones. En utilisant le CP-115, 953, un inhibiteur spécifique de la topoisomérase II, nous avons cartographié les sites de clivage par l'enzyme dans la région du gène codant pour la profiline P: tous les sites détectés se localisent dans la région 5' du gène, mais ne semblent corrélés ni avec la courbure de l'ADN, ni avec sa thermostabilité. La proportion maximale de clivage observée en mitose suggère l'implication de la topoisomérase II dans la ségrégation des chromosomes. Nous avons également identifié la séquence codante de l'enzyme de Physarum en criblant une banque d'ADN complémentaire et par la technique de 3' RACE. Cette topoisomérase II contient tous les motifs caractéristiques de ses homologues eucaryotes, à deux différences près: un domaine C-terminal plus court, et une extension N-terminale atypique potentiellement impliquée dans la régulation ou la localisation de l'enzyme. Nous avons déterminé que le gène codant pour cette enzyme est répliqué au début de la phase S par deux fourches de réplication convergentes qui générent un signal de terminaison au cœur de la région transcrite. Les tentatives d'expression de la protéine dans E. Coli, destinées à étudier les paramètres biochimiques de l'enzyme et à permettre la synthèse d'anticorps spécifiques, n'ont pas permis de produite cette enzyme sous une forme soluble.


  • Résumé

    Type II DNA-topoisomerases are essential enzymes that cut transiently the double helix of DNA. Their ability to modify DNA topology suggests their implication in various processes like transciption and replication. Although their catalytic properties are well established in vitro, their activity and regulation in vivo is not fully characterized. In order to understand the role of these enzymes during the cell cycle, we choose Physarum polycephalum, an eukaryotic organism that is able to form a syncitium containing millions of naturally synchronous nuclei. We mapped the cleavage sites of topoisomerase II at the profilin P gene locus, using CP- 115,953, a specific inhibitor of this enzyme. All the detected sites are localized in the 5' region of the gene, but do not seem to correlate neither with DNA curvature nor its thermostability. We found an increased intensity of cleavage during mitosis, suggesting a role for topoisomerase II in chromosome segregation. We also identified the coding sequence of the enzyme of Physarum through the screening of a cDNA library and the use of a 3' RACE approach. The predicted amino-acid sequence shares similarity with those of other eukaryots, however, it contains a shortened C-terminal domain and an atypica1 N-terminal extension, which function remains unknown. We established that the corresponding gene is replicated early during S-phase and that two converging replication, forks generate a termination signal inside the transcribed region. Finally, in order to study the biochemical properties of the enzyme, we tried to express the topoisomerase II of Physarum in E. Coli. Unfortunately, all the attempts resulted in the expression of an insoluble protein.

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Informations

  • Détails : 206 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.187-205

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)178
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