Etudes mécanistiques de flavodéshydrogénases d'α-hydroxyacides

par David Amar

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Florence Lederer.

Soutenue en 2003

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    La famille des L-2-hydroxyacide oxydases à FMN comprend à la fois des déshydrogénases-oxydases et des déshydrogénases-transférases d'électrons. Ses membres possèdent plus de 30% d'identité de séquence et un repliement très proche, comme l'indiquent les structures des glycolate oxydase, oxydase d'hydroxyacide à longue chaîne (HAO) et flavocytochrome b2 (FCB2). Les résidus catalytiques sont invariants à une exception près pour la HAO. Le substrat physiologique de celle-ci n'est toujours pas connu, cependant il a été récemment montré qu'elle serait responsable de oxydation du créatol, qui n'est pas un hydroxyacide, en méthylguanidine. Pour cette famille, nombre d'expériences sont en faveur d'un mécanisme par carbanion, mais de récents résultats ont conduit certains auteurs à pencher pour un mécanisme par transfert d'hydrure. Nous montrons dans ce travail que le 2-hydroxyphényl acétohydroxamate (HYPAH), un homologue du mandélate (un des meilleurs substrat connu) et du créatol, est oxydé par la HAO. Ce composé se fixe également au site actif du FCB2. Des études comparative de pH en fonction de l'activité pour le mandélate et l'HYPAH, qui se fixerait sous forme ionisée, nous ont renseigné sur les résidus du site actif impliqués dans la catalyse. Nous avons également montré que le benzohydroxamate était un inhibiteur compétitif de la HAO, nos résultats ne laissent pas envisager l'existence d'un intermédiaire éndiolate. Dans une seconde partie, nous avons analysé le comportement du trifluorolactate (F3Lac) et du trifluoropyruvate (F3Pyr) avec le FCB2 et la HAO. La dépolarisation engendrée par les atomes de fluor doit être suffisante pour empêcher le départ d'un hydrure. Nous avons trouvé que le F3Lac est substrat pour le FCB2 et la HAO. La faible activité mesurée pourrait être due au potentiels rédox du couple F3Lac/F3Pyr, nous avons donc testé le F3Pyr dans des conditions de transhydrogénation et nous avons trouvé que la vitesse de cette réaction était rapide dans ce sens.


  • Résumé

    The FMN-dependent L-2-hydroxy acid-oxidizing enzymes family comprises both dehydogenases-oxidases and dehydrogenases-electron transferases. Members display over 30% sequence identity and a strongly conserved fold, as indicated by the structures of glycolate oxidase, its isozyme long-chain hydroxyacid acid oxidase (HAO), flavocytochrome b2 (FCB2) and mandelate dehydrogenase. The catalytic residues are invariant, with one exception in HAO. For this enzyme family, evidence exists in favor of a carbanion mechanism, but recent results have led some authors to consider the possibility of a hydride transfer mechanism. The physiological substrate of HAO is unknown, still it has been recently reported that it could convert creatol, which is not a 2-hydroxyacid, to methylguanidine. We show in this work that 2-hydroxyphenyl acetohydroxamate (HYPAH), a compound that bears similarity both to mandelate (one of the best substrate known) and to creatol, is turned over by HAO. The compound also binds to the active site of homologous FCB2. Comparative pH-rate studies for mandelate and its hydroxamate suggest that HYPAH may bind in its ionized form and gave us information about the catalysis-implicated residues. In addition to these studies, we have found that HAO is competitively inhibited by benzohydroxamate, our results do not support the existence of an enolic intermediate for HAO. We have analyzed, in a second part of this work, the behavior of trifluorolactate (F3Lac) and trifluropyruvate (F3Pyr) towards FCB2 and HAO. The electrostatic attraction exerted by the fluorine atoms must be strong enough to prevent departure of a hydride ion. We find that F3Lac is a substrate both for FCB2 and HAO. The decreased efficiencies measured could be due to a higher redox potential of the F3Lac/F3Pyr couple, so we tested the reduction of F3Pyr by FCB2 and HAO under transhydrogenation conditions, and found the reaction to be quite rapid under these conditions.

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Informations

  • Détails : 137 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.122-136.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)115
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