Ingénierie chimique immunocontrôlée des anticorps : une nouvelle méthode pour la dégradation des neurotoxiques organophosphorés

par Florence Jovic

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Charles Mioskowski.

Soutenue en 2003

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    Une nouvelle stratégie d'obtention d'anticorps catalytiques a été envisagée au laboratoire. Elle consiste à sélectionner des anticorps monoclonaux ayant une double capacité de liaison. D'une part envers le substrat et d'autre part envers un groupe réactif susceptible d'assurer la catalyse. Dans un deuxième temps, les anticorps monoclonaux sélectionnés seront modifiés par accrochage covalent du groupe réactif. L'objectif, in fine, est d'appliquer cette stratégie à l'obtention d'anticorps à activité phosphatase capables de dégrader le VX, agent de guerre chimique neurotoxique. Deux nucléophiles devant jouer le rôle du groupement réactif ont été sélectionnés: une pyridinealdoxime et un diphénylphosphate. Nous avons travaillé sur la synthèse des 2 haptènes correspondants destinés à produire et sélectionner les anticorps. Ces molécules présentent les caractéristiques suivantes: une partie analogue au toxique, le VX; une partie analogue au nucléophile qui sera utilisé pour la catalyse ; une amine primaire permettant le couplage à une protéine porteuse ou reportrice. Les synthèses des deux haptènes correspondant aux nucléophiles sélectionnés ont été menées en parallèle. Après plusieurs modifications de structure, la synthèse de l'haptène " Oxime " a aboutit. L'haptène H a été préparé au laboratoire. Un modificateur M présentant les caractéristiques suivantes a été préparé: la partie nucléophile qui sera utilisée pour la catalyse; une amine primaire devant permettre le couplage à différents agents activables qui seront accrochés covalemment à l'anticorps. Une telle molécule se positionnera dans le site de liaison de l'anticorps par reconnaissance de la partie nucléophile et après accrochage covalent par l'intermédiaire d'une fonction de couplage, le nucléophile sera parfaitement positionné, près du site de liaison du VX pour son hydrolyse. L'haptène a été couplé à une protéine porteuse et injecté à 3 souris Biozzi. Un processus d'immunisation classique a permis d'isoler 10 anticorps monoclonaux possédant de très bonnes affinités vis à vis de l'haptène et de bonnes affinités vis à vis d'un analogue du modificateur. Cela nous assure que le modificateur sera suffisamment bien reconnu pour permettre un positionnement correct dans le site de liaison de l'anticorps après incubation. Un tout premier test utilisant le nucléophile (2-pyridine-aldoxime) comme cofacteur non greffé a mis en évidence une légère accélération de l'hydrolyse du PhX par l'anticorps 19. Ce résultat reste encore à confirmer. Il s'agit donc à présent de mettre au point l'accrochage du modificateur sur les anticorps afin d'obtenir des anticorps catalytiques pour l'hydrolyse du VX.


  • Résumé

    A new strategy has been conceived to achieve catalysis by antibodies. Monoclonal antibodies (mAbs) are first selected according to their binding ability towards two groups. From one hand, they are selected towards a substrate analogue and on the other hand, towards a reactive group capable of hydrolysing the substrate. The second step consists in modifying the monoclonal antibodies by covalently binding the reactive group. The final aim is obtaining a phosphotriesterase-like degradation of organophosphorus chemical warfare VX. Two nucleophiles showing a good reactivity towards VX hydrolysis were selected : a pyridine-aldoxime and a diphenylphosphate. The corresponding haptens are aimed at producing and selecting monoclonal antibodies. These molecules present the following features : an analogous part to the toxic VX; an analogous part to the nucleophile which will be used for the catalysis; a primary amine allowing a coupling reaction for attachment to a carrier protein. The synthesis of the haptens corresponding to the selected nucleophiles have been conducted simultaneously. After a few structural modifications, the preparation of the "Oxime" hapten was completed. Hapten H was thus synthesized in the laboratory. A modifying molecule M with the following characteristics was also prepared : the nucleophilic part which will be used for the catalysis; a primary amine allowing a coupling reaction with different activable agents in order to perform the covalent binding to the monoclonal antibody. Such a molecule will position itself into the antibody binding site by recognition of the nucleophilic part and, after a covalent binding, thanks to an intermediary activable molecule, the reactive group will be perfectly positioned, close to the VX binding site for its hydrolysis. The hapten was coupled to a carrier protein and injected to 3 Biozzi mice. A classical immunizing process alloweded us to obtain 10 monoclonal antibodies possessing very good affinities towards the hapten and good affinities towards the nucleophile. This confirms that the modifying agent will bind tightly enough to the mAbs to allow a good positioning into the antibody binding site after incubation. A very first test using the nucleophile (2-pyridine-aldoxime) as a cofactor exhibited an acceleration for the PhX hydrolysis. This result still remains to confirm. The objective is now to covalently attach the modifying agent to the antibodies in order to obtain catalytic antibodies for the VX hydrolysis.

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Informations

  • Détails : 403 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. en fin de chapitres.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)111
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