Etudes structurales de l'export nucléaire de l'ARNt

par Noémi Fukuhara

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Cristallographie biologique

Sous la direction de Elena Conti.

Soutenue en 2003

à Paris 11 .


  • Résumé

    Ce travail a porté sur l'étude structurale du complexe Exportine-t:RanGTP:ARNt. L'exportine-t est le facteur d'export nucléaire de l'ARNt. Elle appartient à la famille des karyopherines, des transporteurs nucleo- cytoplasmiques composés d'un grand nombre de motifs hélicaux de type HEAT. Pour former un complexe actif d'export nucléaire, l'exportine-t nécessite la petite GTPase Ran, alors que dans le cas de l'import nucléaire (importines), l'interaction avec Ran dissocie le complexe d'import. Ce projet s'est développé selon deux axes: l'étude à basse résolution des changements conformationels subits par les karyopherines lors de leur interaction avec Ran et/ou leur cargo, et l'obtention de la structure du complexe d'export de l'ARNt à haute résolution, dans le but de comprendre les bases moléculaires du processus d'export. Des expériences de diffusion centrale ont révélé pour l'importine beta (la référence chez les karyopherines) et l'exportine-t des changements conformationels importants, entre une conformation étendue à l'état libre et une conformation très compacte à l'état lié (à Ran ou au cargo). Ces résultats contrastent avec ceux obtenus pour la transportine, une autre importine, qui conserve une conformation étendue à l'état libre comme à l'état lié. L'ARNt a aussi pu être positionné dans l'enveloppe basse résolution du complexe ternaire d' export. Parallèlement, j'ai travaillé à l'expression, la purification et la cristallisation du complexe d'export de l'ARNt. J'ai identifié des constructions minimales de Ran et de l'ARNt et stabilisé le complexe. Trois formes cristallines ont pu être obtenues, l'une d'entre elles diffractant potentiellement à 3. 5 A. Néanmoins, plusieurs difficultés ont empêché l'enregistrement d'un jeu de données complet à cette résolution. Les cristaux sont difficiles à reproduire et leur diffraction varie grandement d'un cristal à l'autre. Leur diffraction est aussi anisotropique. Ces cristaux sont actuellement en cours d'optimisation.


  • Résumé

    This thesis work dealed with structural studies of the Exportin-t:RanGTP:tRNA complex. Exportin-t is the specific nuclear export factor for tRNAs. It belongs to the karyopherin family of transport factors, all composed of a large number of helical HEA repeats. Exportins require the small GTPase Ran to form an active export complex, whereas interaction between Ran and importins dissociate import complexes. The project had two main directions: the low-resolution study of conformational changes undergone by importins and exportins upon binding to Ran or cargo, and the obtention of a high-resolution structure of the tRNA export complex in order to understand the molecular basis of the nuclear export process. Solution X-ray and neutron scattering revealed that both importin beta (the reference of the karyopherin family) and exportin-t switch between an extended conformation when free in solution and a compact conformation when bound to cargo- and/or to Ran. This is in contrast to transportin, another well-known importin, which maintains an extended conformation in free and bound states. Scattering experiments with neutrons using the natural contrast of RNA have allowed us to position the tRNA within the complex envelope, providing the first structural view of a nuclear export factor. In parallel, I worked on the expression, purification and crystallization of the tRNA export complex. Minimal constructs of Ran and tRNA could be identified and the complex could be stabilized. Three crystal forms have been obtained so far, among which one potentially diffracts to 3. 5 A. Nevertheless, several problems have prevented the collection of a full dataset at this resolution. The crystals are not easily reproducible and the quality of diffraction varies from one crystal to another. The diffraction is anisotropic as well. These crystals are currently being optimized.

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Informations

  • Détails : 141 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.129-134

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)93
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