Fonction et régulation des oxydoréductases à disulfure : étude comparative des interactions entre le cycle isoalloxazine et son environnement

par Thierry Picaud

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Alain Desbois.

Soutenue en 2003

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    Ce manuscrit présente une étude sur les facteurs structuraux qui modulent les différences d'activité enzymatique et de comportement vis-à-vis de métaux lourds de certaines oxydoréductases à disulfure et nicotinamide (Glutathion réductase (GR), Thiorédoxine réductase (TrxR), et NADH peroxydase (NPX)). Des approches complémentaires combinant des expériences de biochimie à des spectroscopies d'absorption électronique et diffusion Raman de résonance (DRR) ont été utilisées. La réduction de la GR à deux électrons par le substrat (NADPH) ou par le produit (GSH)de la réaction aboutit à la formation de deux espèces différentes. L'étude par DRR de ces deux états réduits a montré que le noyau isoalloxazine du FAD imposait à l'enzyme un contrôle redox et une régulation de son activité via une modulation de la force d'une liaison hydrogène sur l'atome N5. L'inhibition provoquée par l'association de sels métalliques (Hg2+, Cd2+) au dithiol du site actif de la GR est expliquée par le découplage des deux centres redox de la GR (dithiol et FAD) et par une forte distorsion du noyau isoalloxazine, qui engendre des modifications profondes dans les interactions FAD-protéine. Les effets sont tout aussi importants sur la TrxR puisque l'association de ces sels déplace fortement la seconde réduction du FAD de 1 à 3 équivalents de NADPH. Elle permet également de stabiliser beaucoup plus facilement une forme semiquinonique bleue, qui serait un intermédiaire dans une voie de régulation pour cette classe d'enzymes. Les spectres de DRR des différentes espèces redox de la NPX montrent que le cycle isoalloxazine possède connue dans la GR une densité électronique faible. Elle permet la stabilisation de l'acide cystéine-sulfénique et celle du complexe de transfert de charge formé après la réduction de l'enzyme par le NADH.


  • Résumé

    This manuscript presents a study on the characterization of structural factors modulating enzymatic activity and reactivity with metallic ions from members of the pyridine nucleotide disulfide-oxidoreductase family (Glutathione reductase (GR), Thioredoxin reductase (TrxR) and NADH peroxidase (NPX). Complementary techniques combining biochemical experiments, electronic absorption and resonance Raman (RR) spectroscopies have been used. The two-electron reduction of GR by the substrate (NADPH) or the product (GSH) of the enzyme reaction gives rise to the formation of two different species. RR studies of these two-electron reduced states show that isoalloxazine ring of the FAD imposes a redox control and a regulation, of enzyme activity via a hydrogen bond modulation on the N5 atom of FAD. The enzyme inhibition induced by the binding of metallic ions (Hg2+, Cd2+) on the active site dithiol of GR is explained by both an elimination of the redox coupling between the two active centers of GR (dithiol and FAD) and a strong out-of-plane distortion of isoalloxazine moiety that generates strong alterations in FAD-protein interactions. Association of the heavy metal to TrxR produces a displacement of the second redaction step of FAD from 1 to 3 equivalents of NADPH. Moreover, the formation of a blue semiquinone is stabilized. The stabilization of this radical is proposed to be a regulation way for this enzyme class. RR spectra obtained for different redox states of NPX show that the isoalloxazine ring has a low electronic density, as in the case of GR. A direct consequence is the stabilization, of the cysteine-sulfenic acid as well as a charge transfer complex formed after the enzyme redaction by NADH. For the three enzymes, this study showed an intimate electronic coupling between the two redox centers for the two electron-reduced enzymes.

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Informations

  • Détails : 183 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.158-166.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2003)29
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