Etude de l'initiation de la traduction chez Saccharomyces cerevisiae : rôle des IRES

par Valérie Vergé

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire

Sous la direction de Jean-Michel Masson.

Soutenue en 2003

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    Chez les eucaryotes, l'initiation est l'étape limitante de la traduction. La majorité des ARNm est traduite de manière "cap"-dépendante par reconnaissance de la coiffe de l'extrémité 5' de l'ARNm. Un autre mécanisme d'initiation "cap"-indépendant, par entrée interne du ribosome directement au niveau d'une séquence d'ARN dite "internal ribosome entry site" (IRES), a été décrit. L'objectif de la thèse était d'isoler et caractériser des séquences IRES chez la levure et d'évaluer leur intérêt pour l'expression de gènes hétérologues in vivo et in vitro. A plus long terme, l'objectif était une application industrielle de développement d'outils de criblage à haut débit de gènes eucaryotes. Les IRES publiées ou dont on pouvait penser qu'elles seraient actives chez la levure, ont été clonées et évaluées pour la traduction "cap"-indépendante in vitro dans des extraits de traduction acellulaire de Saccharomyces cerevisiae et in vivo chez S. Cerevisiae. Les régions 5' non traduites (5'NTR) des ARNm de YAP1, TF2D, HAP4, eIF4G1 et eIF4E, supposées IRES, ont été testées pour la traduction in vitro d'un gène rapporteur cloné en aval, dans des extraits de S. Cerevisiae. Aucune de ces séquences n'a été fonctionnelle comme IRES dans ces expériences. Pour confirmer ce résultat, des essais par la technique du dicistron ont été réalisés in vivo dans S. Cerevisiae : de nouveau, aucune activité notable des IRES n'a pu être observée. Une analyse plus approfondie de la 5'NTR de eIF4G1, décrite comme l'une des IRES les plus efficaces dans S. Cerevisiae, a révélé que cette séquence n'avait pas d'activité d'initiation interne de la traduction mais agissait comme un promoteur.

  • Titre traduit

    Study of the translation initiation in Saccharomyces cerevisiae : IRES function


  • Résumé

    In eukaryotic cells, initiation is the limiting step of the translation. The majority of mRNAs are translated in a cap-dependant way, by recognition of the 5' cap of the mRNA. Another mechanism of initiation, called internal ribosome entry site (IRES), is cap-independent: the ribosome directly binds the IRES sequence on the mRNA, without needing capping of the mRNA. The purpose of this thesis was to isolate and characterise IRES sequences in yeast and to study the translation IRES-dependant of heterologous genes in vivo and in vitro. It could be interesting to use for an industrial project to develop tools for high-throuput screening of eukaryotic genes. Published IRES or sequences suspected to be IRES were cloned and tested for the cap-independent in vitro translation in yeast extracts of Saccharomyces cerevisiae and in vivo in S. Cerevisiae. The 5'untranslated regions (5'UTR) of mRNA of proteins YAP1, TF2D, HAP4, eIF4G1 and eIF4E, supposed to be IRES, were tested for in vitro translation of a reporter gene cloned downstream, using yeast extracts. In these experiments, none of the sequences tested functioned as IRES. To confirm these results, sequences of the suspected IRES were tested with the dicistronic technic for in vitro translation using yeast extracts: again, no IRES activity could be detected. A deeper study of the 5'UTR of eIF4G1, one of the most efficient IRES described in S. Cerevisiae, showed that this 5'UTR did not act as IRES but contained a promoter

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Informations

  • Détails : 115 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f103-115.

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2003/698/VER
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