Néoformation de plantes d'épinard (Spinacia oleracea L. ) à partir de couches cellulaires minces. : Application à la transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens et par A. rhizogenes

par Stéphanie Leguillon

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Michel Branchard.

Soutenue en 2003

à Brest .


  • Résumé

    L'obtention de plantes d'Epinard à teneur réduite en nitrate, par sur-expression d'un gène du Tabac codant pour le nitrate réductase, passe par la maîtrise de la néoformation de plantes et du transfert de gènes chez cet espèce. Une première partie présente la mise au point d'un protocole efficace de décontamination des semences utilisées comme source de matériel végétal. La technique des couches cellulaires minces transversales (CCMt) , appliquée sur des jeunes plantes, a permis d'obtenir des pousses feuillées et des embryons somatiques après étude de facteurs déterminants comme le génotype, le milieu de développement des plantes-mères, l'origine de l'explant, ou encore la nature et la teneur en régulateurs de croissance. Dans une deuxième partie, les CCMt sont évaluées pour leur aptitude à la transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens en étudiant les effets de la nature de la souche bactérienne, de l'origine de l'explant, ou des milieux de préculture et de coculture. Ainsi, près de 90 % des CCMt infectées se développent en présence de kanamycine et produisent des cals qui expriment l'activité B-glucuronidase. Le protocole retenu, appliqué à l'introduction du gène de la nitrate réductase, conduit à la seule obtention de cals résistants à la kanamycine. La dernière partie aborde la transformation par A. Rhizogenes. Seuls les explants pourvus de l'apex caulinaire émettent des racines de type " hairy root ". Les CCmt prélevées sur ces racines produisent des néoformations à un taux plus élevé que celles issues de racines non transformées. L'analyse de l'activité B-glucuronidase et l'amplification d'une séquence du gène gus par PCR montrent la nature transgénique des plantes néoformées et cultivées jusqu'à la floraison en présence de kanamycine. L'application de cette technique à l'introduction du gène de la nitrate réductase conduit à la néoformation de plantes résistantes à la kanamycine, mais leur analyse par PCR n'a pas permis d'amplifier le gène d'intérêt.

  • Titre traduit

    Plant regeneration from this cell layers in spinarch (Spinacia oleracea L. ). Application to Agrobacterium tumefaciens and A. Rhizogenes mediated-transformation.


  • Résumé

    Spinach, whose Brittany ensures a signifiant share of the french production, strongly accumulates the nitrates whose derivatives would be potentially harmful in terms of public health. The over-expression of tabacco gene coding for nitrate reductase should make it possible to obtain palnts with reduced nitrate content. This project requires the control of both plant regeneration and genetic transformation of spinach. A first part presents the establishment of an efficient protocol for the decontamination, of spinach seeds, which are used as plant source. The technique of the transverse thin cells layers (TTCLs), perfected on young plants from seedlings, allowed to obtain shoots and somatic embryos after study of many deciding factors such as genotype, composition of the germination medium, explant origin or regulator nature and content. In a second-part, tTCLs are evaluated for thier aptitude for genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. The effects of bacterial strain, explant origin, or pre-cultivation and co-cultivation media are evaluated. Thus, almost 90 % of infected tTCLs develop in presence of kanmycin and produce calli that express B-glucuronidase actvity. The protocol of genetic transformation retained, applied to the introduction of the nitrate reductase gene, led to the only obtention of calli resistant to kanamycin. The last part deals with A rhizogenes mediated-transformation. Hairy roots are only emitted from explants with a shoot apex. The tTCLs excised from these roots regenerate plants with a higher rate than those excised from untransformed of a gus gene sequence show the transgenic nature of the regenerated plants grown until flowering in the presence of kanamycin. The protocol, applied to the transfer of the nitrate reductase construct, led to the production of kanamycin-resistant plants, but the PCR analysis did not permit to amplify the gene of interest.

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Informations

  • Détails : 165 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 123-139

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  • Bibliothèque : Université de Bretagne Occidentale. Service commun de la documentation Section Droit-Sciences-STAPS.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TBRE2003/5
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