Caractérisation d'un complexe supra-moléculaire natif interagissant avec le promoteur de la topoisomerase II α humaine

par Lilia Ben Slama

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Pierre Oudet.

Soutenue en 2002

à l'Université Louis Pasteur (Strasbourg) .


  • Résumé

    Les topoisomérases sont des enzymes ubiquitaires, hautement conservées à travers l'évolution, catalysant l'inter-convertion des isomères topologiques de l'ADN. De cette façon elles participent aux processus cellulaires dans lesquels est impliquée la double hélice d'ADN comme la réplication, la transcription, la condensation ou la séparation des chromosomes et la stabilité du génome. Elles sont également les cibles primaires d'un grand nombre d'agents anticancéreux utilisés en chimiothérapie comme les épipodophyllotoxines et les anthracyclines. Nous avons identifié au laboratoire une nouvelle protéine humaine appelée ICBP90 pour " Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa " qui interagit avec la région promotrice de la topoisomérase IIa humaine. Afin d'étudier la fonction biologique de l'ICBP90, nous avons recherché ces partenaires à l'aide du système double-hybride. Les séquences amino-terminale de l'ICBP90 et carboxy-terminale de la protéine ont été employées séparément pour cribler une banque d'ADN complémentaire de lymphocytes T leucémiques (Clontech). Nous avons isolé plusieurs " clones positifs " dont les produits d'expression interagissent avec ICBP90. Ils codent pour des protéines nucléaires connues, impliquées dans différents mécanismes de contrôle de la transcription. Une de ces protéines candidates, interagissant avec l'extrémité amino-terminale de l'ICBP90 est aNAC pour " Nascent polypeptide-Associated Complex ", co-activateur de la transcription interagissant avec c-Jun et TBP. Les protéines RbAp48 pour " Retinoblastoma Binding Protein P48 " co-répresseur de la transcription, interagissant avec Rb, gène suppresseur de tumeurs et Tip60 pour " Tat Interacting Protein of 60kDa " co-activateur de la transcription interagissent avec l'extrémité carboxy-terminale de l'ICBP90. D'autres " clones positifs " ont été isolés, correspondant aux protéines MIF " Macrophage migration inhibitory factor ", facteur de prolifération cellulaire, septin6, interagissant avec MLL, SAS10 " Something About Silencing 10 " protéine impliquée dans la dérépression de la transcription et une protéine putative KIAA0683. L'analyse bio-informatique de ces séquences et la recherche des motifs potentiellement reconnus ont été réalisées. Les protéines aNAC, RbAp48 et Tip60 ont été surexprimées dans un système bactérien sous forme de protéine fusionnée à la GST " Glutathion-S-Transférase " afin de caractériser in vitro les interactions protéine-protéine. Les résultats obtenus par un test biochimique : le " GST pull-down assay " nous permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation d'ICBP90 et de proposer qu'elle pourrait participer à la formation d'un complexe multi-protéique impliqué dans la régulation de la transcription du gène de la topoisomérase IIa humaine.


  • Résumé

    Type II DNA topoisomerases are ubiquitous enzymes highly conserved throughout evolution. They catalyse the interconversion of topological isomers of DNA molecules. This activity is essential for important cellular processes such as transcription and replication of DNA. These enzymes are the target of a large number of anticancer drugs used in chemotherapy such as epipodophyllotoxins and anthracyclines. We have identified in the laboratory a new human protein named ICBP90 for " Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa " that interacts with the promoter region of the topoisomerase IIa gene. In order to study the biological function of ICPB90, we looked for its interaction partners using the two-hybrid system. Both the amino-terminal and the carboxy-terminal regions of ICBP90 were used separately to screen a human leukaemia T lymphocytes cDNA library (Clontech). We have isolated several positive clones whose expression products interact with ICBP90. Three out of six clones encode known nuclear proteins involved in various aspects of transcriptional regulation. One of the candidate proteins, aNAC, interacts with the N-terminal region of ICBP90 and was described as a coactivator of c-jun. The RbAp48 for " Retinoblastoma Binding Protein P48 " and Tip60 for " Tat Interacting Protein of 60kDa " interact with the C-terminal region of ICBP90 and were described as components of Histone Deacetylases (HDAC) and histone acetyltransferases (HAT) respectively. These complexes are involved in chromatin remodelling. Several positives clones were also identified encoding proteins that interact with ICBP90. These proteins are MIF for " Macrophage migration inhibitory factor ", involved in cellular proliferation, septin6 that interact with MLL, SAS10 for " Something About Silencing 10 " involved in silencing and a putative protein KIAA0683. The sequences of these clones were analysed in order to identify potential protein-protein interaction motifs. Finally the aNAC, RbAp48 and Tip60 proteins were overexpressed in a bacterial system as a fusion protein with Glutathion S-Transferase (GST) in order to characterise biochemically their interaction with ICBP90. The GST pull-down assay conformed the previously identified interactions of these proteins with ICBP90. Altogether these results shed new light on the mechanisms by which ICBP90 regulates the expression of topoisomerase IIa gene and suggest that ICBP90 mediates its activity through in a multiprotein complex.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 191 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f.163-182

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2002;4155
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.