Importation mitochondriale d'ARN de transfert : Etude du mécanisme de transport chez la levure et application à la thérapie génique de maladies neuromusculaires humaines

par Olga Kolesnikova

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Robert Martin et de Igor Krasheninnikov.

Soutenue en 2002

à l'Université Louis Pasteur (Strasbourg) en cotutelle avec Moscou .


  • Résumé

    Chez la levure S. Cerevisiae, un seul ARNt codé par l'ADN nucléaire, l'ARNtLysCUU (tRK1), est partiellement importé dans la mitochondrie, le deuxième isoaccepteur de lysine (tRK2) étant localisé uniquement dans le cytosol. Après être aminoacylé par la lysyl-ARNt synthétase cytoplasmique, tRK1 est importée sous forme d'un complexe avec le précurseur de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale. Nous avons construit des transcrits d'ARNt contenant pour partie des séquences de tRK1 et pour partie des séquences de tRK2, ainsi que des transcrits avec des mutations dans l'anticodon. Le résidu C34 s'est révélé être un déterminant positif d'import. Certaines versions mutées étaient importées sous forme misacylée. Ceci nous a permis d'étudier si l'ARNt importé était fonctionnel dans la traduction mitochondriale. In vitro, nous avons trouvé que tRK1CAU était importée étant méthionylé. Après import de l'ARNt chargé par la [35S]-méthionine, nous avons observé l'incorporation de la méthionine marquée dans les produits de traduction mitochondriale. In vivo, nous avons développé un test de suppression d'une mutation Ala->ambre dans le gène COX2 mitochondrial. Nous avons démontré que le phénotype de déficience respiratoire était supprimé par l'expression dans le noyau d'un ARNt suppresseur importable. Nous avons exploité ces données pour développer un système artificiel d'importation d'ARNt dans cellules humaines. Un tel système permettrait d'utiliser la thérapie génique des maladies mitochondriales résultant de mutations dans l'ADN mitochondrial. Nous avons démontré que les mitochondries humaines étaient capables d'importer tRK1 et plusieurs de ses formes mutées in vitro et in vivo. Nous avons ensuite exprimé des versions importables de tRK1/2 dans les cellules cybrides contenant une mutation dans le gène de l'ARNtLys mitochondrial causant le syndrome MERRF. Nous avons observé que les cellules exprimant ces transgènes avaient partiellement récupéré leur capacité respiratoire.


  • Résumé

    In the yeast S. Cerevisiae, a single nuclear-coded tRNA, tRNALysCUU (tRK1), is partially imported in the mitochondria, while the other lysine isoacceptor is restricted to the cytosolic (tRK2) compartment. To be imported, tRK1 must be aminoacylated by the cytoplasmic lysyl-tRNA synthetase and to interact with the precursor mitochondrial lysyl-tRNA synthetase. We constructed chimaeric tRNA transcripts containing in part sequences of tRK1 and in part sequences of tRK2, and tRK1 transcripts containing all possible one-base replacements in the anticodon. We found that the position C34 was a positive import determinant. Some mutant versions were imported in misacylated form. This was exploited to address the question of the functionality of the imported tRNA in mitochondrial translation. In vitro, we used the fact that the version tRK1CAU was imported in its methionylated form. After import of [35S]-methionine charged tRNA, we observed that the labeled amino acid was incorporated into mitochondrial translation products. In vivo, we developped a suppression assay in a strain bearing an Ala-to-amber mutation in the mitochondrial COX2 gene. The respiratory deficient phenotype could be suppressed by expression in the nucleus of an importable suppressor tRNA. We exploited these data to develop an artificial tRNA import system in human cells. Indeed, such a system could allow the use of gene therapy to cure mitochondrial diseases resulting from mutations in mitochondrial genes. We demonstrated that human mitochondria internalize tRK1 and several of its mutant versions in vitro and in vivo. We next used cybrid cell lines bearing mutation A8344G in the tRNALys gene (causing the MERRF syndrome). These cybrid lines are known to be respiratory deficient. Importable tRK versions were expressed in these cells and the clones expressing the transgenic tRNAs above a certain threshold level were shown to have partially recovered from their respiratory defect.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 29 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.27-29

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2002;4131
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.