Etudes structurale et fonctionnelle des enzymes HPr-kinases/phosphorylases

par Sonia Fieulaine

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Sylvie Nessler.

Soutenue en 2002

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    Les enzymes HPr-kinases/phosphorylases (HprK/P) régulent la répression catabolique du carbone chez les bactéries à Gram positif; cette voie de signalisation permet aux bactéries de s'adapter rapidement à la disponibilité en sources de carbone facilement métabolisables. Les enzymes HprK/P sont des protéine-kinases, dont le substrat est la protéine HPr. Elles sont bifonctionnelles : elles sont capables de phosphoryler mais aussi de déphosphoryler leur substrat. Les enzymes HprK/P appartiennent à une nouvelle famille de protéine-kinases et de protéine-phosphatases. Les travaux présentés dans ce manuscrit ont permis de caractériser ces enzymes, en particulier par leur étude de la structure tridimensionnelle. La résolution de la structure du domaine catalytique C-terminal de la protéine HprK/P de Lactobacillus casei a permis de montrer que l'enzyme adopte un repliement connu, caractéristique des protéines à P-loop, comme la PEP-carboxykinase. La protéine est hexamérique dans le cristal comme en solution. L'analyse de la structure ainsi que l'étude de mutants de la protéine ont permis d'identifier le site actif de l'enzyme, et de montrer que les deux activités sont portées par le même site actif. La résolution de la structure de la protéine HprK/P de Staphylococcus xylosus a permis de décrire le repliement du domaine N-terminal, et de montrer qu'il ressemble à d'autres protéines. L'étude structurale du complexe HprK/P:HPr, de stœchiométrie 6:6, a permis de caractériser le mode d'interaction entre les deux protéines, et de proposer un mécanisme de phosphorylation par transfert direct du phosphate. Un deuxième complexe obtenu en présence de phosphate inorganique a permis de montrer que le mécanisme de déphosphorylation consiste en une réaction inhabituelle de phosphorolyse : le phosphate est substrat de la réaction et le pyrophosphate un produit. L'ensemble de ces travaux confirme que les enzymes HprK/P appartiennent à une nouvelle famille de protéine-kinases.


  • Résumé

    HPr-kinase/phosphorylase (HprK/P) controls carbon catabolite repression (CCR) in Gram-positive bacteria. CCR is a signaling pathway that allows bacteria to respond quickly to environmental conditions and to the availability of metabolizable carbon sources. HprK/P enzymes are protein-kinases, and their substrate is the HPr protein. HprK/P are bifunctional: they phosphorylate and dephosphorylate the HPr protein. HprK/P enzymes thus form a new protein-kinase and protein-phosphatase family. The results presented in this manuscript enabled us to characterise these enzymes, through the study of their three-dimensional structure. After determining the structure of the C-terminal catalytic domain of Lactobacillus casei HprK/P we were able to show that this protein fold had already been identified: it is the same as that of P-loop containing proteins, such as PEP-carboxykinase. HprK/P is hexameric in crystal form as it is in solution. Structural interpretation as well as mutant protein analysis have allowed us to identify the enzyme's active site, and to show that there is only one active site carrying both enzymatic activities. The determination of the structure of Staphylococcus xylosus HprK/P enabled us to describe the fold of the N-terminal domain, and to show that it is related to other known proteins. The structural study of the HprK/P:HPr complex, with a 6:6 stoechiometry, allowed us to characterise the interactions betweens the proteins in the complex, and to propose a phosphorylation mechanism by direct transfer of the phosphate group. A second complex obtained in the presence of inorganic phosphate allowed us to show that the dephosphorylation mechanism consists of an unusual phosphorolysis reaction: the phosphate ion is a substrate of the reaction and the product is a pyrophosphate molecule. Taken together, these results confirm that HprK/P enzymes form a new family of protein-kinases.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 197 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.135-145.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2002)208
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.