Effets de la Tosyl Phénylalaline Chlorométhyl Cétone (TPCK) sur l'activation de la NADPH oxydase de neutrophiles humains

par Maggaly Gillibert

Thèse de doctorat en Biologie. Biochimie

Sous la direction de Florence Lederer.

Soutenue en 2002

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    La NADPH oxydase se situe dans la membrane des cellules phagocytaires. Elle est constituée de deux protéines membranaires, formant le cytochrome b558, et de quatre protéines cytosoliques. Lors de l'activation, les facteurs cytosoliques sont phosphorylées, ils transloquent et s'associent au cytochrome qui produit alors l'anion superoxyde. L'activation fait intervenir des voies de signalisation complexes. Le Tosyl-Phénylalanine-Chlorométhyl-Cétone (TPCK), inhibiteur de protéases, inhibe la NADPH oxydase. Cependant, aucune protéase ne semble impliquée dans la production d'anion superoxyde et le TPCK inhibe d'autres protéines. Au laboratoire, des tests cinétiques ont montré que l'incubation des neutrophiles avec le TPCK, avant ou après activation par le phorbol myristate acétate (PMA), inhibe l'activation de la NADPH oxydase en modifiant une protéine cytosolique de 15 kDa. Par immunoblot, il est montré ici que le TPCK inhibe et réverse la translocation de p47phox et p67phox. Par contre, il n'a aucun effet sur la translocation de Rac 2. Le TPCK peut aussi empêcher l'association à la membrane de p67phox et Rac 2, présentes dans les membranes de cellules non activées. Le marquage des cellules au [32P], montre que le TPCK inhibe et réverse la phosphorylation de p47phox. La purification partielle de la cible, marquée avec du TPCK tritié, n'a pas permis de l'identifier. L'ensemble des résultats montre que le TPCK touche un élément de la signalisation cellulaire et active une phosphatase qui pourrait être impliquée dans la l'activation/désactivation de la NADPH oxydase et dans l'organisation du cytosquelette. L'identification de la cible permettra de mieux expliquer les effets observés. A long terme, cela pourra peut-être permettre de réguler l'activité de cette enzyme localement grâce à la synthèse d'inhibiteurs plus spécifiques que le TPCK. Ces inhibiteurs pourront alors être utilisés dans un but thérapeutique dans les maladies inflammatoires impliquant la NADPH oxydase.


  • Résumé

    NADPH oxidase is located in phagocytic cells membrane. It is made of two membrane proteins, bath forming the cytochrome b558, and four cytosolic proteins. After activation, cytosolic factors are phosphorylated, they transolocate to the membrane and associate to the cytochrome, which produces superoxide anion. NADPH oxidase activation requires complex signaling pathways. Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone (TPCK), a protease inhibitor, is known to inhibit this enzyme activity. However, no protease implicated in superoxide production bas ever been identified. Furthermore, it is now known that TPCK also inhibits the activity of other proteins. This laboratory bas shown that incubation of neutrophils with this inhibitor, before and after stimulation with Phorbol Myristate Acetate (PMA), inhibits activation of NADPH oxidase by modifying a cytosolic protein of 15 kDa. Using immunoblots, it is shown here that p47phox and p67phox translocation is inhibited and reversed by TPCK treatment. The TPCK bas no effect on Rac 2 translocation. It is also observed that TPCK prevents p67phox and Rac 2 membrane association in non-activated cells. Using [32P] labeling and immuno-precipitation, it is shown that p47phox phosphorylation is also inhibited and reversed by TPCK. A partial purification of the TPCK target, using tritiated TPCK, didn't allow the identification of this protein. Taken together, these results show that TPCK target is an important element in cellular signaling. Incubation of neutrophils with TPCK certainly activates a phosphatase, which could be involved in NADPH oxidase activation/deactivation and cytoskeleton organization. The target identification is an important step to explain TPCK effects. Furthermore, this will give the opportunity to synthesize specific NADPH oxidase inhibitors to locally control superoxide anion production in a therapeutic goal.

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Informations

  • Détails : 209 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.170-199.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2002)151
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