Bases moléculaires du processus d'émergence et de propagation du prion Ure2p de la levure saccharomyces cerevisiae

par Carine Thual

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Ronald Melki.

Soutenue en 2002

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    L'élément génétique non-Mendélien [URE3] de la levure est dû à la perte de la fonction de Ure2p, une protéine impliquée dans la répression azotée de la voie d'utilisation de l'ureidosuccinate. L'inactivation de Ure2p se propage de façon autonome, elle est donc héritable. Comme les autres protéines prions, cette inactivation se produirait lors de son assemblage en fibres amyloïdes composées de structures en feuillets b. Un changement de la conformation de Ure2p est attendu au cours de la conversion de la forme soluble et fonctionnelle de la protéine en forme insoluble inactive. Nous avons exprimé Ure2p dans E. Coli et démontré qu'elle est une protéine à deux domaines. Le domaine N-terminal (résidus 1-93) est flexible et déstructuré, tandis que le domaine C-terminal (résidus 95-354) est compact. Ure2p s'oligomerise en solution pour former majoritairement des dimères qui s'assemblent en fibres qui lient le colorant Rouge Congo. Les fibres sont similaires à celles formées par la PrP ou Sup35p. La cinétique d'assemblage suit typiquement le processus de nucléation-propagation décrit pour les protéines amyloïdes. Nous avons ensuite analysé les propriétés des domaines N- et C-terminaux de Ure2p. Nous avons exprimé chaque domaine séparément, mais il n'a pas été possible d'obtenir le domaine N-terminal pur. Nous montrons que la dimérisation de Ure2p implique uniquement le domaine C-terminal, qui complémente la délétion du gène URE2 in vivo. Ure2p dépourvue de son domaine N-terminal est incapable de s'assembler en fibres ou d'incorporer des fibres amyloïdes préformées. Ce résultat souligne le rôle crucial du domaine N- terminal dans l'assemblage de la protéine. Un variant de Ure2p entière qui possède un tryptophane supplémentaire dans son extrémité N- terminale a été générée pour suivre les changements conformationnels affectant ce domaine. La comparaison de la conformation globale de Ure2p, du variant W37Ure2p et du domaine C-terminal de Ure2p révèle que le domaine N-terminal de Ure2p ne confère aucune stabilité supplémentaire à la forme soluble de la protéine. Ceci contredit l'hypothèse de l'interaction intra-moléculaire entre les régions N- et C-terminales de Ure2p présentées dans d'autres études. Finalement, ce travail montre clairement qu'aucun changement majeur n'affecte la conformation globale de Ure2p au cours de son assemblage en fibres. Il est admis que la forme d'une protéine qui s'assemble en fibres amyloïdes est partiellement dépliée. Les cinétiques de dénaturation à l'équilibre de Ure2p obtenues à différents pH, révèlent l'existence d'un intermediaire stable de dépliement en présence de 2 M de Guanidinium-CI. Cet intermédiaire existe uniquement dans des conditions de pH où les fibres se forment. Cet intermédiaire a été caractérisé. . .


  • Résumé

    The non-Mendelian genetic element [URE3] of the yeast is due to the loss of the function of Ure2p, a protein involved in the nitrogen-dependent repression of the ureidosuccinate utilization pathway. Ure2p inactivation is self-perpetuating, thus heritable. Like the other prion proteins, inactivation of Ure2p is widely believed to occur by its assembly into amyloid fibrils which contain cross b-sheets structures. A change in the conformation of Ure2p may account for the conversion of the protein from a soluble and functional state to an insoluble inactive state. We expressed Ure2p in E. Coli and demonstrated that Ure2p is a two domain protein. The N-terminal domain (1-93) is flexible and unstructured, while the C-terminal domain (95-354) is compactly folded. Ure2p oligomerizes in solution to form mainly dimers that assemble into fibrils that bind the dye Congo Red. The fibrils are similar to those formed by PrP or Sup35p. The kinetic of assembly is typical of a nucleation-propagation process described for amyloid proteins. We have further analyzed the properties of Ure2p N- and C-terminal domains. We expressed each domain separately, but it was not possible to obtain the N-terminal domain pure. We show that dimerization of Ure2p involves solely the C-terminal domain, which complements URE2 gene deletion in vivo. Ure2p devoid of its N-terminal domain is unable to assemble or incorporate into preformed amyloid fibrils. This result underlines the crucial role of the N-terminal domain in directing the assembly of the protein. A full-length Ure2p variant that possesses an additional tryptophane residue in its N-terminal moiety was generated in order to follow conformational changes affecting this domain. Comparison of the overall conformation of Ure2p, W37Ure2p variant and Ure2p C-terminal fragment reveals that Ure2p N-terminal domain confers no additional stability to the soluble form of the protein. N-terminal domain confers no additional stability to the soluble form of the protein. This is in contradiction with the hypothetical intra-molecular interaction between the N- and C-terminal moieties of Ure2p presented in a number of previous studies. Finally, this work clearly shows that the overall conformation of Ure2p is not affected during its assembly into fibrils. It is believed that the form of a given protein that assembles into amyloid fibrils is a partially unfolded polypeptide chain. . .

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Informations

  • Détails : 109 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.93-98.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2002)63
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