Génération de rhabdovirus aquatiques recombinants par génétique inverse

par Stéphane Biacchesi

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Michel Brémont.

Soutenue en 2002

à Paris 11, Orsay .


  • Résumé

    Le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV) est la cause de pertes économiques importantes pour les élevages piscicoles. L'IHNV est un virus enveloppé à ARN négatif simple brin appartenant à la famille des Rhabdoviridés. Un système de génétique inverse a été élaboré pour l'IHNV afin de permettre la manipulation du génome et ainsi l'obtention de souches vaccinales. Les conditions de températures compatibles avec les températures de réplication de l'IHNV (14ʿC) et du virus de la vaccine recombinant (vTF7-3, 37ʿC) exprimant l'ARN polymérase T7 ont été établies à l'aide d'un minigénome. Puis, un IHNV recombinant, identique au virus sauvage, a été néoformé après la transfection dans des cellules de poissons infectées par le vTF7-3 d'un ADNc complet du génome de l'IHNV cloné sous contrôle du promoteur T7 et de 3 vecteurs d'expression codant les protéines du complexe réplicatif viral. Ce système a ensuite permis d'étudier la possibilité d'échanger la glycoprotéine G de l'IHNV par celles d'autres Rhabdovirus. Les résultats obtenus ont démontré que l'insertion d'une glycoprotéine hétérologue dans les virions de l'IHNV ne nécessitait pas la conservation d'un motif spécifique. Cette extrême flexibilité de l'IHNV a de plus été montrée par l'échange fonctionnel et simultané de la protéine de matrice M et de la glycoprotéine, par celles d'un Rhabdovirus de parenté éloignée. Enfin, l'IHNV a été utilisé comme vecteur de gènes. Comme gène d'intérêt, le gène codant l'interleukine-1β (IL1) de truite arc-en-ciel a été choisi, cette cytokine possédant des propriétés d'adjuvant immun chez le poisson. Une cassette d'expression a donc été inserée entre les gènes M et G. L'expression du gène IL1, dans les cellules infectées, a été détectée par Northern-blot démontrant ainsi que la séquence UCURUC(U)_7RCCGUG conservée dans les régions intergéniques du génome viral contenait les signaux suffisants et nécessaires à la polymérase virale pour la synthèse d'un ARNm additionnel.


  • Résumé

    Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) is a serious viral pathogen causing significant economic losses in fish farms. IHNV is a enveloped virus with a negative-sense single-stranded RNA genome belonging to the Rhabdoviridae. Thus, a reverse genetic system was developed for IHNV allowing to manipulate the viral genome. In a first step, the use of a minigenome allowed us to establish the conditions of temperatures compatible with the temperatures for the IHNV growth (14ʿC) and that of the recombinant vaccinia virus (vTF7-3, 37ʿC) expressing the T7 RNA polymerase. Then, a recombinant IHNV, similar to the wild-type virus, was recovered following the cotransfection of a full length cDNA of the IHNV genome cloned under the control of the T7 promotor together with the three expressing vectors encoding IHNV replicative complex proteins into fish cells infected by the vTF7-3. This powerful system then allowed us to study the ability to exchange IHNV glycoprotein G with those of other Rhabdovirus. The results obtained showed the nonspecific motif requirement for the insertion of heterologous glycoproteins into IHNV virions. This extreme flexibility of IHNV to accomodate heterologous proteins was underlined by the functional and simultaneous exchange of two major structural proteins, the matrix protein M and the glycoprotein G, by those of a distantly related Rhabdovirus. Finally, IHNV was used as a gene vector. The gene encoding the rainbow trout interleukine-1β (IL1) was chosen as gene of interest, this cytokine has properties of immune adjuvant in fish. The IHNV genome was modified by the insertion of an expression cassette between genes encoding the M and G proteins. The IL1 gene expression, in the infected cells, was detected by a Northern-blot assay showing thus that the UCURUC(U)_7RCCGUG sequence conserved into the intergenic regions of the IHNV genome contained the signals sufficient and necessary to the viral polymerase for the synthesis of an additional mRNA.

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Informations

  • Détails : 237 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.183-209.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : M/Wg ORSA(2002)50
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