Developpement d'une approche rapide et universelle pour la preparation des puces a partir de proteines synthetisees in vitro en vue de l'etude des interactions intermoleculaires

par Marina Snapyan

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de VEHARY SAKANYAN.

Soutenue en 2002

à Nantes .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Ce travail concerne la creation de puces a partir de proteines synthetisees in vitro. Nous avons developpe un nouveau systeme acellulaire bacterien, depourvu des activites majeures proteasique et nucleasique, contenant une quantite elevee de chaperonines thermostables et supplemente par la sous-unite de l'arn polymerase d'echerichia coli et/ou par l'arn polymerase de thermus thermophilus, qui a permis d'assurer une synthese importante des proteines actives a partir d'une matrice d'adn lineaire portant des signaux forts pour la transcription et la traduction. Les proteines synthetisees ont ete purifiees et immobilisees sur un phase solide afin d'utiliser les puces a proteines pour l'etude des interactions intermoleculaires (proteine-adn, proteine-proteine, proteine-ligand). Les sondes correspondantes ont ete marquees avec des fluorophores emettant dans la zone de l'infrarouge lointain qui a permis d'augmenter considerablement la sensibilite de la detection des signaux. Des puces soustractives avec les proteines argr d'origines differentes, la sous-unite de l'arn polymerase et la proteine regulatrice ampc dependante ont ete appliquees pour etablir la specificite et les conditions optimales de la detection des interactions intermoleculaires. Notre approche a egalement ete utilisee pour l'identification des interactions a partir des puces creees avec des extraits cellulaires bruts prouvant sa sensibilite importante. Enfin, nous avons prepare une puce soustractive de 14 proteines putatives de la bacterie hyperthermophile thermotoga maritima appartenant aux familles des regulateurs laci, gntr et xylr et nous avons identifie des proteines capables d'interagir avec des operateurs heterologues et avec la sous-unite de l'arn polymerase d'e. Coli. L'approche elaboree peut etre utilisee pour la caracterisation en serie de proteines de differents organismes.


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Informations

  • Détails : 220 p.
  • Annexes : 189 ref.

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  • Bibliothèque : Université de Nantes. Service commun de la documentation. BU Sciences.
  • Disponible pour le PEB
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