Ingénierie rationnelle de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea : de la structure tri-dimensionnelle aux bases moléculaires de la catalyse

par Cécile Albenne

Thèse de doctorat en Biologie - Santé. Biotechnologie

Sous la direction de Magali Remaud.

Soutenue en 2002

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase de la famille 13 des glycoside-hydrolases qui utilise le saccharose pour synthétiser un homopolymère de type amylose et glucosyler très efficacement des accepteurs tels que le glycogène. L'obtention et l'analyse de complexes enzyme : substrat couplée à des expériences de mutagénèse dirigée, nous ont permis de montrer que la spécificité vis-à-vis du saccharose est conférée par des résidus du sous-site -1 (Asp144, Arg509, Tyr147 et Phe250). Les résidus du sous-site +1 (Asp394 et Arg446) assurent un positionnement correct des molécules acceptrices et sont responsables de la spécificité de synthèse mais aussi de rupture des liaisons a-1,4. En effet, nous avons révélé la capacité de l'AS à disproportionner efficacement les maltooligosaccharides de DP > 4, la présence d'un sous-site +4 fort (Arg415), associé à des sous-sites +1, +2 et +3 faibles (résidu Arg226 gênant), réduisant fortement l'accès au site actif des plus petites molécules. Une analyse approfondie des réactions catalysées en présence de saccharose seul nous a ensuite permis de démontrer que la formation du polymère résulte d'une élongation non-processive des maltooligosaccharides produits par l'AS, du côté de leur extrémité non-réductrice. Alors que les produits < DP4 sont accumulés du fait d'une fixation défavorable au niveau des sous-sites +1 à +3, la glucosylation des longues chaînes repose sur un arrimage performant au niveau de différents sites positionnés à la surface de l'enzyme. Enfin, un site secondaire, non catalytique, de fixation du saccharose a été révélé et pourrait être responsable du comportement cinétique atypique de l'AS, via de possibles modifications conformationnelles. Une étude de modélisation moléculaire a été initiée pour explorer l'éventualité d'une voie de passage pour le saccharose entre le site secondaire et le site actif. La modélisation a également permis de proposer une solution d'arrimage du glycogène, révélant une complémentarité de forme entre l'enzyme et cet accepteur

  • Titre traduit

    Rational design of amylosucrase from Neisseria polysaccharea : from the three-dimensional structure to molecular description of catalysis


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    Amylosucrase from Neisseria polysaccharea (AS) is a transglucosidase from family 13 of glycoside-hydrolases which uses sucrose to synthesize an amylose-like polymer and elongates acceptor molecules as glycogen. Enzyme-substrate complexe analyses associated to site directed mutagenesis experiments allowed us to show that residues of subsite -1 are responsible for the specificity towards sucrose (Asp144, Arg509, Tyr147, Phe250). Residues of subsite +1 (Asp394, Arg446) ensure a correct positionning of acceptor molecules and are responsible for the specificity of synthesis but also of cleavage of the a-1,4 linkage. Indeed, we have showed that AS is able to disproportionate efficiently maltooligosaccharides of DP > 4. A strong subsite +4 (Arg415), associated to weak subsites +1, +2 and +3 (Arg226), reduce the accessibility of small molecules to the active site. A deep analysis of the reactions catalysed from sucrose led us to demonstrate that polymer synthesis result from the non-processive elongation of maltooligosaccharides synthesised by AS, at the non-reducing end. Opposed to compounds of DP < 4 which are accumulated because of a weak binding at subsites +1, +2 and +3, longer molecules are efficiently glucosylated thanks to a strong binding at different sites situated on the surface of the enzyme. A non-catalytic sucrose binding site has been identified and should be responsible for the atypical kinetic behavior of AS, via conformationnal movements. A molecular modelling study was initiated to explore the trajectory of sucrose between this secondary sucrose binding site and the active site. Molecular modelling was also used to propose a solution of docking of glycogen, which reveal a groove complementary to a branch of glycogen on the surface of the enzyme

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Informations

  • Détails : 275 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 242-266

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2002/674/ALB
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