Dédoublement enzymatique d'acides alpha-halogéno aryl acétique : Approche expérimentale et modélisation moléculaire

par David Guieysse

Thèse de doctorat en Biologie - Santé. Biotechnologie

Sous la direction de Pierre Monsan.

Soutenue en 2002

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    L'étude a porté sur le dédoublement d'acides alpha-halogéno aryl acétique catalysé par les lipases. Ces composés sont utilisés pour la synthèse de molécules pharmaceutiques, ou autres, optiquement pures. Dans un premier temps, plusieurs lipases (RML, PCL, CALB, CRL, HLL) ont été testées pour leur capacité à dédoubler l'alpha-bromo-o-tolyl acétate d'éthyle en réaction de transestérification avec l'octanol. Une énantiosélectivité maximale de E=11,3 a été obtenue avec la lipase de R. Miehei immobilisée sur polypropylène, laquelle est plus sélective que la lipase libre. D'autre part, la lipase de P. Cepacia s'est révélée être beaucoup plus énantiosélective pour les substrats portant la substitution méthyle en position méta et para sur le cycle aromatique (E>50). Dans un deuxième temps, parmi tous les paramètres susceptibles de modifier l'énantiosélectivité de la lipase de P. Cepacia pour le dédoublement de l'alpha-bromo phényl acétate d'éthyle, nous avons mis en évidence que la sélectivité de la lipase était fortement influencée par la nature de l'halogène du centre asymétrique ainsi que par la nature nucléofuge de la partie alkyle du substrat. L'immobilisation du biocatalyseur modifie également la sélectivité de la lipase. Enfin, par modélisation moléculaire, nous avons identifié les processus moléculaires responsables de la sélectivité de la lipase de P. Cepacia pour l'énantiomère (R) de l'alpha-bromo phényl acétate d'éthyle (E=57). L'approche que nous avons suivie n'a jamais été décrite dans la littérature. Pour la première fois, en retraçant les trajectoires de chaque énantiomère dans le site actif de la lipase et sur la base des énergies d'interaction enzyme/substrat, nous avons montré que le site actif de l'enzyme est moins accessible à l'énantiomère (S) qu'à l'énantiomère (R). Un réseau d'acides aminés hydrophobes à chaînes latérales pivotantes (Val, Leu), tapissant les parois du site actif, semble intervenir dans le cheminement du substrat vers le site actif. En particulier, deux acides aminés Val-266 et Leu-17 forment un goulot d'étranglement qui semble intervenir dans la discrimination des énantiomères. La détermination de l'énantiosélectivité du mutant V266L porteur à la position 266 d'une chaîne latérale plus encombrante a confirmé ce résultat. En effet, pour ce mutant, la taille du goulot d'étranglement est réduite et l'énantiosélectivité est supérieure à 200.

  • Titre traduit

    Enzymatic resolution of alpha-halogeno aryl acetic acids : experimental approach and molecular modelling


  • Résumé

    This study focused on lipase-catalysed resolution of alpha-halogeno aryl acetic acids. These compounds are used for the synthesis of enantiomerically pure pharmaceutical molecules. Several lipases (RML, PCL, CALB, CRL, HLL) were screened for their ability to catalyse the enantioselective transesterification of alpha-bromo-o-tolyl ethyl acetate with n-octanol. The best enantioselectivity was obtained with R. Miehei lipase immobilized on polypropylene (E=11. 3), which was more stereoselective than the free one. On the other hand, P. Cepacia lipase was more enantioselective for the meta- and para-tolyl substrates (E>50). Among all the factors susceptible to modify the P. Cepacia lipase enantioselectivity for the resolution of alpha-bromo phenyl ethyl acetate, we showed that lipase selectivity was dramatically influenced by the halogen at the stereo-centre and by the leaving alcohol constituting the alkyl part of the substrate. The immobilization of the biocatalyst also modifies the selectivity of lipases. Finally, by molecular modelling, we attempted to identify the molecular processes responsible for P. Cepacia lipase selectivity for (R)-alpha-bromo phenyl ethyl acetate (E=57). The approach used, had never been described in the literature. For the first time, the trajectory of each enantiomer to the active site was mapped and the energy of enzyme/substrate interactions was calculated along the path. On the basis of interaction energy, we showed that the enzyme active site is less accessible for the S-enantiomer than for the R-one. A hydrophobic network of amino acids with pivoting side chains (Val, Leu), covering the sides of the active site, seems to play a role in driving the substrate to the active site. In particular, two amino acids Val-266 and Leu-17 form a bottleneck. We suggest that this structural fracture influences the discrimination of R,S-enantiomers. The determination of the enantioselectivity of the mutant V266L with a side chain more bulky at this position, supported this assumption. In fact, for this mutant, the size of the bottleneck is reduced, and the enantioselectivity was found to be higher than 200

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Informations

  • Détails : 232 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 203-221

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2002/644/GUI
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