Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin et de son fragment de 60kDa : Purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations

par Laurent Poulouin

Thèse de doctorat en Biochimie cellulaire

Sous la direction de Jean-Marie Imhoff.

Soutenue en 2002

à Cergy-Pontoise .


  • Résumé

    Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. La combinaison de trois étapes de chromatographie d'affinité sur gélatine et sur héparine permet de purifier d'importantes quantités de fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain ou de plasma citraté. Les rendements obtenus sont de 7. 00 +/- 0. 77 milligrammes de fibronectine par gramme de cryoprécipité et de 0. 16 milligramme de fibronectine par millilitre de plasma. En optimisant les conditions d'élution, nous obtenons des fractions homogènes sur gels SDS-PAGE. L'utilisation de sera polyclonaux en immunorévélation montre que notre fraction est homogène et qu'elle n'est contaminée ni par le fibrinogène ni par le facteur von Willebrand. Aucune activité protéolytique ne peut être détectée par zymographie sur gélatine ou après incubation jusqu'à 456 heures à 37ʿC en présence de calcium, de zinc et de mercure. Les caractéristiques physicochimiques et physiologiques de la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes, appelée highly purified fibronectin (hpFN), sont identiques aux préparations issues d'autres protocoles. Nous pouvons purifier, avec une grande pureté, un fragment de 60kDa (F60) comportant les domaines de liaison aux collagènes (CBD) après hydrolyse de la fibronectine par la trypsine. Les cartographies qualitatives des glycosylations de la fibronectine et du fragment ont été réalisées grâce à des lectines végétales. Ces travaux permettent de proposer de nouvelles méthodes de purification ou d'analyse des interactions entre la protéine et ses ligands. Les résultats obtenus par cette caractérisation et nos protocoles de purification permettent d'envisager l'étude des interactions cellulaires et moléculaires faisant intervenir la fibronectine et ses fragments. Nous proposons d'ores et déjà un protocole original d'étude des interactions entre la fibronectine et le collagène de type I basé sur l'utilisation des lectines végétales.


  • Résumé

    Large amounts of soluble fibronectin were purified from cryoprecipitated or fresh citrated human blood plasma by a three-step combination of gelatin and heparin-cellufine affinities chromatography. The yield obtained was 7. 00 +/- 0. 77 mg of fibronectin per gram of cryopecipitated plasma. By optimizing the elution conditions, we obtained a homogeneous fraction on SDS-PAGE and Western blot. Neither fibrinogen or von Willebrand factor may be detected by western-blot. No proteolytic activities were detected by zymography on gelatin. Furthermore, the fibronectin preparation was stable over time up to 456 hours at 37ʿC in the presence of either calcium, zinc or mercury. Physical and physiological conformations of fibronectin prepared by this three-step protocol are identical with fibronectins purified with other available protocols. From this preparation of very stable fibronectin, called high purified fibronectin (hpFN), we purified after trypsin-hydrolysis a 60kDa fragment (F60) containing the Collagen Binding Domain (CBD). Glycosylations of native protein and fragment were analysed by dynamic mapping and give possible ways to purify and study interactions between fibronectin compounds and theirs ligands. These purified and stable preparations may be useful for cellular tests or interaction analysis. In this latter aim, we have begun study interactions between fibronectin and type I collagen by an original lectin-based protocol.

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Informations

  • Détails : 137 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f.21-17. Index

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  • Bibliothèque : Université de Cergy-Pontoise. Bibliothèque universitaire. Site de Saint-Martin.
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  • Cote : TS CERG 2002 POU
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