Protéolyse enzymatique d'un gel : microrhéologie et mécanisme de dégradation

par Giulia Fadda

Thèse de doctorat en Biophysique

Sous la direction de Véronique Larreta-Garde.

Soutenue en 2002

à Cergy-Pontoise .


  • Résumé

    La matrice extracellulaire est un réseau complexe de macromolécules qui enveloppe les cellules et isole les organes. Cette matrice est composée d'un ensemble de protéines et de polysaccharides variés qui sont sécrétés localement par les cellules et assemblés en un réseau organisé, en association étroite avec la cellule qui les a produits. Certains processus biologiques comme l'invasion cellulaire, impliquée notamment dans les métastases, nécessite que la cellule traverse cette barrière physique. Pour cela la cellule produit des enzymes (protéinases) catalysant l'hydrolyse des protéines et provoquant la dégradation et la liquéfaction du gel. L'étude de ce phénomène a été entreprise sous deux aspects différents. Le premier volet de ce travail concerne le développement d'un outil expérimental permettant de sonder les propriétés rhéologiques d'un gel à une échelle proche de celle d'une cellule. Pour cela nous avons réalisé des expériences de diffusion quasi-élastique de la lumière sur des particules sondes d'un diamètre de 0. 5 micron dans des solutions de gélatine (collagène dénaturé). Nous avons étudié la façon dont la dynamique de ces particules est affectée par la gélification de la solution et notamment par le comportement critique des grandeurs rhéologiques (viscosité et module élastique). Certains aspects techniques liés à la non-ergodicité du gel sont discutés. Le second volet concerne l'étude expérimentale du mécanisme de dégradation d'un gel de gélatine par la thermolysine. Sous l'action de cette enzyme une transition inverse de la gélification est observée. Au moyen de la technique de microrhéologie préalablement développée, nous avons montré que pour de très faibles concentrations en enzyme ([E] de l'ordre du nanomolaire) la vitesse de dégradation enzymatique varie comme [E]ø, alors qu'un mécanisme classique laisse prévoir un comportement linéaire. Ce résultat s'interprète en envisageant un mécanisme de dégradation limité par une diffusion anormale et sous-diffusive de l'enzyme dans le gel. Cette diffusion anormale a été mise en évidence par des mesures de corrélation de fluorescence en microscopie biphotonique sur des enzymes marquées.


  • Résumé

    The extracellular matrix is a complex macromolecular network which envelops cells and isolates the organs. This matrix is made up of various proteins and polysaccharides which are locally secreted by the cells and assembled together in order to form an organised network (gel like). This network has close interactions with the cells which produced it. Some biological process, as cellular invasion, for example, which is involved in particular on metastases, need the cell to cross this physical barrier. In order to do that, the cells produce some enzymes (proteinases) which catalyze protein hydrolysis and cause the liquefaction of the gel. We have sudied this phenomen on two different aspects. The first part of this work concerns the developpement of an experimental set-up which enable the study of the rheological properties of a gel at a length scale similar to that of a cell. This set-up consists in the study, by quasi-elastic light scattering, of the dynamics of probe particles having a diameter of about 0. 5 æm, in a polymer or a protein solution. In particular, we have studied, with this technique, how the dynamics of the probes is affected by the gelation of an 1% gelatin solution and notably by the critical behavior of the viscosity and the elastic modulus of the gelatin solution. Some technical aspects due to a loss of the ergodicity of the system while gelation occurs are also discussed. In the second part of this work we have studied the degradation of a gelatine gel due to the action of a proteinase (thermolysin). The action of the enzyme was revealed by an inverse phase transition (gel-sol transition). By means of the microrheology technique we have developped, we observed that for very weak enzyme concentration ([E] ~ nM), the enzymatic reaction rate V depends on the enzyme concetration as [E]ø. For a classical enzymatic reaction we expected a linear dependence. We interpreted this result on considering a degration mechanism which is limited by an anomalous and sub-diffusif motion of the enzyme on the gel. Measurements on the same system with correlation fluorescence spectroscopy, showed an anomalous diffusion behavior as well.

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Informations

  • Détails : 136 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury

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  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS CERG 2002 FAD
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