Calmodulines et germination chez le pois (Pisum sativum L. ) : aspects biochimiques et moléculaires

par Frédéric Duval

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire végétale

Sous la direction de David Macherel.

Soutenue en 2002

à Angers .


  • Résumé

    La calmoduline (CaM) est une protéine de transduction du signal calcium (Ca2+), ubiquiste et dont la structure est très conservée parmi les eucaryotes. L'expression de mutiples isoformes de CaM est un signe distinctif de cette protéine chez les végétaux supérieurs. Elles n'ont pas d'activité catalytique propre mais interviennent spécifiquement dans de nombreuses voies métaboliques associées au développement ou aux réponses aux stress. Des analyses menées par spectrométrie de masse ont permis d'identifier trois isoformes protéiques de CaM dans les graines de pois. Elles diffèrent par des substitutions uniques d'acides aminés au sein de la première hélice alpha N-terminale. Les gènes de CaM appartiennent à une petite famille multigénique. Les ADNc pleine longueur codant les trois isoformes (PsCaM1, 2 & 3) ont été clonés et ont permis de déduire des amorces spécifiques dessinées dans les régions 5' et 3' non-traduites les plus divergentes. Les études d'expression, menées par RT-PCR semi-quantitative, ont montré une accumulation différentielle de chaque transcrit au cours de la germination. PsCaM1 & 2 sont détectés en quantités différentes dans les axes embryonnaires et les cotylédons secs, puis s'accumulent au cours de l'imbibition jusqu'à la percée de la radicule, alors que PsCaM3 apparaît au moment de la percée de la radicule et son niveau augmente progressivement dans les axes et les cotylédons. Afin de caractériser les propriétés biochimiques de chaque isoforme, les trois protéines ont été surexprimées dans Escherichia coli sous forme de protéines de fusion avec un Strep-tag (CaM1-ST, CaM2-ST & CaM3-ST). Les expériences de réactivation de la NAD kinase CaM dépendante de pois ont donné les mêmes résultats pour les trois protéines. Par contre, les analyses fonctionnelles utilisant la technique de gel-retard ont montré des différences entre les trois isoformes. CaM1-ST se lie de manière stoechiométrique au peptide synthétique dérivé du site de fixation de la CaM sur la CaM Kinase II, alors que CaM2-ST et CaM3-ST présentent une affinité moindre pour ce peptide. En utilisant un autre peptide synthétique idéal, Trp-3, ces affinités sont encore plus réduites. L'étude ultérieure de la distribution cellulaire de la CaM et l'identification des enzymes cibles de la CaM au cours de la germination permettront d'élucider l'implication des diverses isoformes de CaM dans les voies métaboliques associées à la germination.

  • Titre traduit

    Biochemical and molecular aspects of calmodulins in pea germination. . .


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Informations

  • Détails : 144 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.133-144

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