Analyse de l'expression des gènes dans les cellules rénales : recherche de transcrits spécifiques et mise au point d'une approche globale

par Bérangère Virlon

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Jean-Marc Elalouf.

Soutenue en 2001

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) (autre partenaire) .

Le président du jury était Jean Feunteun.

Le jury était composé de Jean-Marc Elalouf, Jean Feunteun, Philip Avner, Michel Paillard, Jacques Marti.

Les rapporteurs étaient Philip Avner, Michel Paillard.


  • Résumé

    La génomique fonctionnelle suscite actuellement un engouement considérable, mais la banalisation de cette approche n'est pas à la mesure des espoirs qu'elle a engendrés. Notre projet de thèse a consisté à explorer la faisabilité de la mise en place d'une méthode de génomique fonctionnelle, et à valider son utilisation pour l'analyse à grande échelle de l'expression de gènes dans des microéchantillons biologiques. Dans un premier temps, l'expression rénale des gènes codant pour les GRKs (G protein-coupled Receptor Kinase) a été étudiée en utilisant des oligonucléotides susceptibles d'amplifier tous les membres de cette famille. Deux ADNe de rat codant pour deux isoformes de GRK4 produites par épissage alternatif, ont été caractérisés. Dans un second temps, la méthode d'analyse en série de l'expression des gènes (SAGE), qui permet une caractérisation quantitative des transcrits d'un tissu, a été mise en place, et son domaine d'utilisation a été élargi en la rendant applicable à des microéchantillons (30 000 cellules). La technique SADE (Sage Adaptation for Downsized Extracts) que nous avons mise au point a permis l'analyse de 67 000 étiquettes d'ADNe rénaux. Cette analyse de transcriptome a porté sur le rein entier et, pour la première fois, sur 3 segments différents du néphron, à partir desquels plusieurs milliers d'étiquettes ont pu être générées. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence l'expression, attendue ou pas, de marqueurs de ces différents segments. L'approche SADE est donc applicable à l'étude du transcriptome de toute population cellulaire rare, comme les cellules isolées à partir d'un organe hétérogène, les cellules embryonnaires ou les cellules obtenues à partir de biopsies.


  • Résumé

    Despite great advances in functional genomics methods and the progress they promise in the molecular understanding of many biological mechanisms, there are still important limitations to their widespread application. Our goal was to test the feasibility of one functional genomics technology in a classic academie laboratory and to validate its use for large-scale gene expression studies in small biological samples. First, renal expression of genes encoding GRKs (G protein-coupled Receptor Kinases) was analysed. RT-PCR carried out on the rat kidney with GRK­ specific primers enabled us to clone two cDNAs that encode two rat GRK4 splice variants. Next, we intented to develop SAGE (Serial Analysis of Gene Expression), i. E. A method for large-scale quantitative analysis of gene expression. We successfully performed SAGE at the whole-kidney level. In addition, we were able to scale clown the method, which makes possible the analysis of homogenous kidney cell populations, such as those obtained by microdissecting nephron segments (30,000 cells). This modified SAGE assay, referred to as Sage Adaptation for Downsized Extracts (SA DE), enabled us to analyse, for the first time, the transcriptomes of three nephron segments. A total of 67,000 renal tags were then generated, which was away to provide the expression level of known and unknown renal markers. SADE broadens consistently potentiality of SAGE, by allowing transcriptome analysis of rare populations of cells, like cells isolated from heterogeneous tissues, embryos or tissue biopsies.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (206 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.186-206

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Paris-Sud (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne). Service Commun de la Documentation. Section Médecine.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TD/2001T017
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 5773
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