Remodelage fonctionnel de la neocarzinostatine : creation par evolution in vitro d'une nouvelle capacite de reconnaissance moleculaire dans une ossature proteique

par BERNADETTE HEYD

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de Philippe Minard.

Soutenue en 2001

à Paris 11 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    L'objectif du travail est de creer dans une proteine un nouveau site de fixation pour une molecule choisie a priori. L'approche repose sur un processus d'evolution artificiel realise in vitro a partir d'une ossature proteique. La neocarzinostatine (ncs), membre de la famille des chromoproteines, a ete choisie comme ossature potentielle. Sa petite taille (113 residus), sa stabilite relativement grande, sa structure tridimensionnelle sont des caracteristiques a priori favorables. Une construction permettant a la fois une expression tres efficace de la proteine et son exposition a la surface des phages filamenteux a tout d'abord ete developpee, puis validee. Les proprietes de la proteine recombinante ainsi obtenue montrent qu'elle est correctement structuree. Nous demontrons ensuite que la crevasse correspondant au site naturel de fixation du ligand peut etre remodelee par ingenierie combinatoire de facon a ce qu'elle reconnaisse une autre molecule, ne presentant aucun lien avec son partenaire naturel. Pour cela, sept residus de la crevasse ont ete rendus aleatoire par mutagenese aleatoire localisee. Un repertoire de 7 10 8 variants independants a ete obtenu puis utilise pour les selections par exposition sur phage. Nous avons pu selectionner deux variants reconnaissant la testosterone avec une affinite relativement forte (k d50 nm). Leurs sequences, bien qu'independantes, sont nettement convergentes. Des etudes de specificite avec des analogues steroides revelent que la reconnaissance pour la testosterone est specifique. Ces resultats demontrent qu'il est possible de creer une authentique capacite de reconnaissance moleculaire sur une ossature proteique autre qu'un anticorps.


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Informations

  • Détails : 161 p.
  • Annexes : 188 ref.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
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