Genes codants pour la cytochrome p450 reductase du champignon rhizopus nigricans. Clonage par l'expression dans la levure et caracterisation

par BARBARA KUNIC

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de DENIS POMPON.

Soutenue en 2001

à Paris 11 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Ce travail presente l'etude du role des proteines redox associees au cytochrome p450, la nadph-cytochrome p450 reductase et le cytochrome b5, ainsi que leur implication dans la reponse induite par l'exposition du champignon filamenteux rhizopus nigricans a la progesterone. Les arnms specifiquement produits en reponse a la progesterone ont ete amplifies par rt-pcr en utilisant des amorces de sequence degeneree. Les primers ont ete definis en comparant les regions tres conservees de liaison au fmn et fad chez les reductases connues. Les adnc correspondant aux regions centrales de deux nouvelles reductases nommees cpr1-cs et cpr2-cs ont ete clones. D'autre part, par clonage fonctionnel dans une souche de levure s. Cerevisiae dont le gene cpr1 est sous le promoteur conditionnel et le gene cyb5 est inactive, nous avons identifie deux adnc, dont l'expression permet d'abolir l'hypersensibilite au ketoconazole d'une telle levure : un adnc long codant pour une reductase (cpr1-fl) qui inclut la sequence cpr1-cs et un adnc codant pour un cytochrome b5 (cyb5-1). L'etude de l'expression par nothern blot montre que deux transcrits de 2,1 kbp (cpr1-fl et cpr2-cs), correspondent aux reductases que nous avons clonees. Seule cpr1-fl est fortement induit (8-fois) lors de la reponse a la progesterone. Par contre l'expression de cpr2-cs et cyb5-1 n'est pas modifiee. La localisation cellulaire et de la fonction du produit de cpr1-fl ont ete etudiees dans une souche de levure dont le gene de la cpr1 endogene a ete prealablement interrompu. Cette analyse conduite en utilisant l'adnc complet cpr1-fl ainsi qu'une version tronquee commencant au premier atg trouve en 5 - (cpr-s) revele que ces deux adnc codent pour des produits fonctionnellement equivalents localises dans le cytosol et les microsomes. L'addition d'un codon atg immediatement en amont du premier atg de l'adnc de cpr1-fl (cpr1-l) accroit la fraction de l'activite presente dans les microsomes : la resistance au ketoconazole est accrue, alors que l'activite nadph-cytochrome c reductase globale se trouve diminuee. L'adnc du cyb5-1 a ete reformate et son produit surexprime et surproduit dans e. Coli. Puis solubilise par des detergents et purifie. Il montre un spectre d'absorption et des proprietes redox typiques du cytochrome b5. De plus il module fortement les activites testosterone hydroxylase and ethoxycoumarin deethylase des p450 3a4 et 2b6 humains de maniere dependante de la nature de la reductase. L'ensemble des donnes montre que trois composants du systeme monooxygenase de rhizopus nigricans ont ete clones et caracterises. Leur implication differente en reponse a la progesterone a ete demontre.


  • Pas de résumé disponible.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 200 p.
  • Annexes : 175 ref.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.