Imagerie des declins de fluorescence pour l'etude de la dynamique et des interactions de macromolecules en cellules vivantes

par MARC TRAMIER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de MAITE COPPEY MOISAN.

Soutenue en 2001

à Paris 6 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Le but de notre travail est de developper une imagerie des declins de fluorescence et d'en demontrer les potentialites pour l'etude de la dynamique macromoleculaire et des interactions entre macromolecules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la correlation temporelle de photons uniques de fluorescence (tcspc) simultanement a la determination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la region d'emission. Des images monodirectionnelles de declins de fluorescence ont ainsi ete obtenues representant la cinetique de fluorescence en differentes regions subcellulaires. Nous avons egalement mis au point la mesure de declins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 m 3) sous microscope en mode confocal. Les resultats presentes dans ce memoire demontrent l'interet de cette approche technologique pour des problematiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogene de proteines a ete realise en les fusionant a la gfp ou un de ses variants spectraux. Les interactions proteine-proteine ont ete etudiees soit par heterofret en mesurant la diminution de la duree de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homofret en mesurant la cinetique de depolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en evidence (i) la formation d'heterodimeres de p45 du facteur de transcription nf-e2 avec deux partenaires dans differents compartiments subcellulaires par heterofret, et (ii) l'homodimerisation de la thymidine kinase du virus de l'herpes simplex type 1 de facon plus concluante par homofret que par heterofret. Par ailleurs, la mesure des declins d'anisotropie de fluorescence de l'ethidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'adn a revele l'existence d'une tres forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbee. Les developpements supplementaires de notre systeme pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.


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  • Détails : 246 p.
  • Annexes : 205 ref.

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  • Cote : PMC RT P6 2001
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