Etude in vitro de la terminaison de la retrotranscription du vih-1 et de son implication potentielle dans la maturation du complexe de pre-integration

par LAURENCE HAMEAU

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de ERIC LE CAM.

Soutenue en 2001

à Paris 6 .

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  • Résumé

    Au cours des dernieres annees, des avancees decisives ont ete faites dans la comprehension des mecanismes de l'infection par le vih-1. Neanmoins, certaines etapes du cycle replicatif du virus restent encore des boites noires, en particulier celles de la phase precoce. Apres l'entree de la capside virale dans la cellule, le complexe nucleoproteique issu du cur viral est le siege de la retrotranscription, etape caracteristique des retrovirus qui consiste en la synthese d'une molecule d'adn double brin a partir du genome arn viral. Cet adn va etre importe dans le noyau ou il sera integre dans le genome cellulaire. L'import nucleaire de l'adn viral s'effectue au sein d'un complexe nucleoproteique dit de pre-integration, qui derive directement de celui ou a lieu la retrotranscription. Le complexe de pre-integration du vih-1 n'a pas encore ete clairement detaille, les interactions entre les differents constituants n'etant pas encore connus, sauf dans le cas de l'integrase qui se trouve associee aux extremites ltr de l'adn viral. La maturation du complexe de retrotranscription en complexe de pre-integration resulte au moins en partie de la retrotranscription, processus changeant la nature de l'acide nucleique viral et ainsi bouleversant les interactions nucleoproteiques. Une des particularites de l'adn proviral du vih-1 est sa region centrale qui, sur le brin d'adn (+), presente une discontinuite avec un chevauchement de brin d'une centaine de nucleotides au centre du genome, nomme flap central. Cette structure est engendree du fait d'une double initiation de la synthese du brin (+), de par la presence de deux amorces 3ppt et cppt, et de la terminaison de la synthese du brin initie au 3ppt au centre, au site cts. Recemment, il a ete mis en evidence une activation par le flap central de l'import nucleaire de l'adn du vih-1 ou de vecteurs derives. L'objectif de nos recherches etait de pouvoir apprehender le complexe de pre-integration du vih-1 en mimant in vitro la dynamique retrovirale aboutissant a celui-ci. Ceci nous a amenes a developper un systeme de synthese d'adn in vitro, permettant d'etudier la synthese du brin (+) de l'adn viral dans la region cppt-cts, generant le flap central, en presence de partenaires proteiques potentiels. Pour cela, nous avons optimise la purification d'adn simple brin, en controlant la qualite des preparations par microscopie electronique. Nous avons alors analyse la synthese d'adn en presence de la proteine de nucleocapside (ncp), qui est la proteine recouvrant le genome viral dans le cur du virion. Nos resultats mettent en evidence que la ncp favorise suffisamment la processivite de la transcriptase inverse pour accelerer la synthese de l'adn en flap central, tandis que la reaction se termine toujours dans le cts. Nous avons aussi etudie les complexes formes entre la ncp et l'adn en cours de synthese par la transcriptase inverse. Il s'avere que la synthese a partir d'adn simple brin en presence de ncp s'effectue dans des agregats, sous forme de corps denses, qui se desorganisent au cours de la reaction, laissant s'echapper les molecules d'adn double brin. Ceci presume de rearrangements des interactions nucleoproteiques au cours de la retrotranscription, en particulier de la dissociation progressive de la structure nucleocapsidique durant la synthese d'adn. En ce qui concerne les proteines virales vpr et integrase, elles n'influent pas de maniere significative sur la synthese d'adn par la transcriptase inverse, alors qu'elles semblent se concentrer dans des halos en peripherie des agregats formes par l'adn simple brin et les ncp. Par ailleurs, nous avons mis au point la production d'un mine de l'adn viral, contenant la region en flap central, ainsi que les sequences ltr de part et d'autre. Cette etude a permis de mettre en evidence l'activation chez le vih-1 de la synthese de l'adn en flap central par la ncp en fin de retrotranscription. Elle permet aussi de proposer que le mecanisme de maturation du complexe de retrotranscription en complexe de pre-integration implique une activite de moteur moleculaire de la transcriptase inverse aboutissant a la dissociation massive de la nucleocapside. D'autre part, l'etude in vitro du mine d'adn non-integre est en cours de developpement. Ses interactions avec les proteines du complexe de pre-integration permettront d'apprehender l'architecture du complexe de pre-integration. La mise au point de son import nucleaire dans des cellules permeabilisees permettra de detailler les divers mecanismes deja proposes et d'en evaluer les impacts respectifs.


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Informations

  • Détails : 190 p.
  • Annexes : 379 ref.

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  • Cote : PMC RT P6 2001
  • Bibliothèque : École normale supérieure. Bibliothèque.
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  • Cote : LBPA / THE HAM
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