Biochemical and structural analysis of human ndp kinase b associated to dna

par SHARONA GIL-RAVEH

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de MICHEL VERON.

Soutenue en 2001

à Paris 6 .

    mots clés mots clés

  • Titre traduit

    Analyse biochimique et structurale de la ndp kinase humaine de type b associee a l'adn


  • Résumé

    La nucleoside diphosphate kinase catalyse la phosphorylation reversible d'un nucleoside triphosphate a un nucleoside disphosphate. Elle est presente de maniere ubiquitaire dans tous les organismes, de la bacterie a l'humain. Recemment, la ndp kinase a ete impliquee dans les mecanismes de regulation comme la differenciation, la proliferation et la dissemination metastasique des tumeurs humaines. Une des isoformes humaines de cette enzyme, la ndp kinase b codee par le gene nm23-h2 a recemment ete impliquee dans la regulation de l'expression de l'oncogene c-myc. Elle est capable de se fixer a l'adn et cette activite pourrait etre impliquee dans certaines de ses fonctions de regulation. Nous avons etudie les proprietes du complexe ndp kinase b/adn. L'etude in vitro de l'interaction entre la proteine recombinante avec les oligonucleotides correspondant a la region nhe du promoteur de c-myc a ete effectuee par differentes (fluorescence intrinseque de la proteine et polarisation de fluorescence). L'activite de fixation a l'adn est specifique de la ndp kinase b humaine qui se fixe preferentiellement a l'adn simple brin sans specificite de sequence. Les oligonucleotides, qui sont des inhibiteurs competitifs de l'activite enzymatique, presentent une meilleure affinite que les nucleotides substrats. Ces resultats indiquent que le site catalytique de la ndp kinase b participe a la fixation de l'adn simple brin. La combinaison d'une methode de pontage utilisant un laser uv et de la spectometrie de masse a permis d'identifier 4 peptides en contact avec l'oligonucleotide au sein du complexe adn/proteine. Les resultats des experiences de fluorescence et les cinetiques enzymatiques demontrent egalement que la presence d'une guanine a l'extremite 3-oh de l'oligonucleotide augmente de facon significative l'affinite. Afin d'identifier quels determinants structuraux sont responsables de cette discrimination de la guanine vis a vis des autres bases, nous avons construit le mutant ponctuel e152q. Les resultats montrent que le glutamate c-terminal est directement implique dans la reconnaissance selective de la guanine presente a l'extremite 3 d'un aptamer. Ces resultats nous ont permis de proposer un modele structural qui rend compte de la fixation d'un 30-mer oligonucleotide a la molecule de ndp kinase b hexamerique. Ainsi, la ndp kinase b apparait etre un facteur de transcription non conventionnel de la famille des facteurs de transcription architecturaux. Nous proposons un mecanisme moleculaire par lequel la ndp kinase b stimule la transcription de c-myc ou d'autres genes portant des structures de promoteurs similaires


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Informations

  • Détails : 182 p.
  • Annexes : 188 ref.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
  • Consultable sur place dans l'établissement demandeur
  • Cote : T Paris 6 2001 104
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 2001
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