Régulation négative de l'interaction entre les sous-unités adaptatrices de la PI3-kinase et les protéines de signalisation de l'insuline et l'IGF-1, recherche de nouveau(x) partenaire(s) de la phosphotyrosine phosphatase SHP-2 ainsi que de gênes dont l'expression est régulée par la serine/threonine kinase PKB

par Laurent Delahaye

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Emmanuel Van Obberghen.

Soutenue en 2001

à Nice .


  • Résumé

    Les récepteurs à activité tyrosine kinase de l'insuline et l'IGF-1 s'autophosphorylent sur des résidus tyrosine après fixation de leur ligand respectif, créant des sites d'ancrages pour les différents substrats de ces récepteurs comme les protéines IRS (Insulin Receptor Substrat) ou Shc. Ces protéines substrats sont ensuite phosphorylées par les récepteurs puis recrutent et activent les protéines de signalisation possédant des domaines SH2 comme la tyrosine phosphatase Shp-2 ou les sous-unités régulatrices de la PI 3-kinase. Ces protéines sont impliquées dans la transduction du message intracellulaire dont le résultat est le contrôle d'activités enzymatiques ou de l'expression de gènes impliqués dans l'homéostasie du glucose ou la croissance cellulaire par exemple. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de la sous-unité régulatrice p55PIK de la PI 3-kinase dans la voie de signalisation de l'IGF-1. Nous avons déterminé les régions importantes de p55PIK qui interagissent avec la sous-unité catalytique p110 de la PI 3-kinase ainsi qu'avec le récepteur de l'IGF-1. Nous avons déterminé in vitro que p55PIK interagie avec le récepteur de l'IGF-1 purifié et que cette interaction dépend de l'état d'activation du récepteur. De plus, dans des cellules intactes stimulées par l'IGF-1, p55PIK interagie avec le récepteur de l'IGF-1 et IRS-1. Grâce à un mutant dominant négatif de p55PIK, nous avons mis en évidence une boucle de rétrocontrôle négatif de l'interaction de p55PIK avec ses partenaires, due à la production de D3-phosphoinositides par l'activité PI 3-kinase. Dans un deuxième temps, nous avons voulu caractériser le rôle de résidus sérine de IRS-1 qui jouxtent les tyrosines constituant les sites potentiels d'association de IRS-1 aux sous unités régulatrices de la PI 3-kinase. Pour cela, nous avons utilisé un système de double hybride modifié dans la levure et nous avons démontré que la mutation des sérines 662 et 731 en alanines de IRS-1 (IRS-1 S662A/S731A) augmente son interaction avec les sous-unités régulatrices p85 et p55PIK de la PI 3-kinase par rapport à IRS-1 sauvage. Dans des cellules intactes exprimant IRS-1 S662A/S731A, nous avons mis en évidence une augmentation de l'activité de la sérine/thréonine PKB en absence de toute stimulation par l'insuline comparé à des cellules qui expriment IRS-1 sauvage. Nous avons ensuite recherché de nouvelles molécules qui interagissent avec Shp-2 et qui pourraient jouer un rôle dans la signalisation de l'insuline. Pour cela nous avons criblé une banque d'ADNc de placenta humain à l'aide du système double hybride modifié dans la levure. Nous avons mis en évidence que la protéine FRS2 peut s'associer à Shp-2 lorsque FRS2 est phosphorylée par le récepteur de l'insuline. Nous avons démontré que FRS2 est phosphorylée in vitro par le récepteur de l'insuline. Dans des cellules surexprimant le récepteur de l'insuline, nous avons trouvé que FRS2 est phosphorylée en réponse à l'insuline et s'associe avec Shp-2. FRS2 serait donc un nouveaux substrat du récepteur et s'associerait avec Shp-2 après stimulation par l'insuline. Enfin, nous avons cherché à mettre en évidence des gènes dont l'expression est contrôlée par PKB. Pour cela, nous avons transfecté des cellules HepG2 avec un mutant constitutivement actif de PKB (Myr-PKB) puis nous avons trié les cellules par la technique de MACS pour ne récupérer que les cellules exprimant Myr-PKB. Nous avons préparé ensuite les ARN totaux de ces cellules et comparé le profil d'expression des ARNm de ces cellules par rapport à celui de cellules contrôle par hybridation soustractive par suppression (HSS). Après isolement de clones positifs, le séquençage des ADNc a révélé deux clones dont l'identité est à 98 % homologue au gène de la phospholipase du groupe IIA sécrétée (sPLA2). Ainsi dans nos conditions expérimentales, nous avons mis en évidence que la sPLA2 voit l'expression de son gène augmenter dans des cellules exprimant le mutant Myr-PKB par rapport aux cellules contrôles. PKB régulerait positivement l'expression de sPLA2 dans les cellules HepG2.

  • Titre traduit

    Negative regulation of interaction between regulatory subunits of PI 3-kinase and proteins from the insulin and IGF-1 signaling pathways, searching fot new SHP-2 patner and new PKB-regulated gene expression


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Informations

  • Détails : 133 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 99-133. Résumé en français

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  • Bibliothèque : Université Nice Sophia Antipolis. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 01NICE5658
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  • Disponible pour le PEB
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