Etude du répertoire Vk des souris Biozzi bonnes ou mauvaises productrices d'anticorps à l'aide de banques de phages. Isolement et utilisation intracellulaire de fragments d'anticorps anti-phosphotyrosine

• Auteur / Autrice : Chang-Hoon Nam
• Direction : Jean-Luc Teillaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Compiègne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris de laboratoire

Facteur de croissance de l'épiderme

Anticorps

Bactériophages

Gènes

Résumé

L'objectif de notre travail a été de caractériser et de comparer le répertoire des régions variables VK exprimées dans les lymphocytes B spléniques de souris Biozzi "Bonnes" ou "Mauvaises" productrices d'anticorps, d'isoler à partir d'une banque combinatoire de fragments d'anticorps simple chaîne ("scFv"), établie à partir de souris Biozzi BP immunisées, des scFvs dirigés contre les motifs phosphotyrosine (pY), et d'étudier les conséquences de l'expression intracellulaire de l'un de ces scFvs dans des cellules tumorales stimulées par "l'Epide al Growth Factor" (EGF), Dans un premier temps, nous avons pu montrer, en comparant 100 séquences VK provenant de souris BP ou MP "naïves", que les souris BP présentaient une expression plus hétérogène des familles VK que les souris MP : près de 40% de ces dernières appartiennent à la famille 9, alors que les régions VK des souris BP se distribuent de façon égale principalement entre trois familles (familles 4/5, 9 et 21). De plus, 12% des régions VK des souris BP se classent dans la catégorie "Miscellanous" de la classification de Kabat, alors qu'aucune région de ce type n'a été trouvée chez les souris MP, confirmant la plus forte hétérogénéité du répertoire VK des souris BP. Une variabilité identique -au sens de Kabat- a été observée dans les régions VK des deux lignées de souris. Cependant, lorsque chaque séquence a été comparée à chacune des 154 séquences germinales Vx de la banque de données du "National Center for Biotechnology Information" (NCBI), une différence a été observée entre les scores d'alignements des souris BP et MP, du fait d'une fréquence de substitutions de nucléotides plus importante dans les régions VK des souris BP que dans les souris MP. Une comparaison base par base des régions VK des souris BP et MP, appartenant aux familles 9 et 21, avec chacune des séquences germinales de ces deux familles, a permis de suggérer un phénomène de conversion génique, survenant fréquemment chez les souris BP. Dans un second temps, nous avons comparé le répertoire VK exprimé par les lymphocytes B spléniques de souris Biozzi BP, avant et après immunisation contre des motifs phosphotyrosine couplés à une protéine porteuse. Nous avons pu montrer que la sélection de régions VK au cours de l'immunisation conduit à l'expansion de cellules B exprimant des régions Vx appartenant à la famille 4, et, parmi celles-ci, à une dominance de régions VK dérivées de la séquence germinale aa4. Des événements somatiques incluant mutations ponctuelles et conversion génique ont été trouvés dans les répertoires avant et après immunisation. Nous avons alors isolé des scFvs and-phosphotyrosine à partir d'une banque de phages, scFvs qui possèdent des régions Vk dérivées de la séquence aa4. Ces régions VK anti-phosphotyrosine présentent des mutations tout à la fois dans leurs régions hypervariables et dans leurs régions charpentes. Sécrété sous forme soluble, le scFv anti-pY PYSK7, a une affinité apparente de 6. 0±1. 5x108 M-l et une capacité à lier les motifs pY de protéines phosphorylées, tant en ELISA que dans des tests d'immuno-empreinte. Cet anticorps lie notamment le récepteur de l'EGF phosphorylé. Des études menées par immunofluorescence indirecte ont ensuite montré que ce scFv, après expression intracellulaire clans les cellules de la lignée de carcinome épidermoïde A431, se répartit clans le cytoplasme sous forme d'amas. Par contre, la stimulation de ces cellules par l'EGF provoque une mobilisation massive de ce scFv à la membrane et induit de façon spécifique une apoptose importante des cellules, soulignant l'intérêt éventuel de ce scFv comme outil d'inhibition de voies de transductions mobilisées par un ligand donné.