Les RNases H eucaryotes : étude comparative sur des substrats modèles et obtention d'inhibiteurs aptamétriques sélectifs

par Frédéric Pileur

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et médicales. Biologie-Santé

Sous la direction de Christian Cazenave.

Soutenue en 2001

à Bordeaux 2 .


  • Résumé

    Les RNAses H sont des enzymes qui hydrolysent spécifiquement le brin ARN d'un hybride ARN/ADN. Celles-ci sont retrouvées tout au long des règnes animaux et végétaux. Elles participent à l'enlèvement des fragments d'Okazaki lors de la synthèse discontinue de l'ADN. Un rôle dans la transcription est également suspecté. Il existe deux classes de RNases H, la classe I (type 2) et la classe II (type 1), la classification reposant sur des critères biochimiques généraux (sensibilité au NEM, concentration en cations divalents à l'optimum d'activité, poids moléculaire). Tandis que les enzymes de classe I eucaryotes sont localisées dans le noyau, les enzymes de classe II sont retrouvées dans le cytoplasme et la mitochondrie. Les RNases H cellulaires sont aussi connues pour leur action dans les effets d'oligodésoxyribonucléotides antisens. Dans un souci d'optimisation d'oligonucléotides antisens et pour détenir un nouveau critère de classification, nous avons décidé d'étudier le comportement de RNases H eucaryotes de différentes origines sur les hybrides de 20 nucléotides de long. Nous avons analysé les premières coupures de chaque hybride. Il s'est avéré que les RNases HI testées (origine bovine et humaine) préféraient l'extrémité 3' des ARN engagés dans la formation d'hybrides tandis que les RNases HII coupaient à 6 et 8 nucléotides de l'extrémité 5' de ces mêmes ARN. De plus, grâce à ce nouveau critère de nouvelles informations en faveur d'une localisation mitochondriale des RNases HII eucaryotes ont été obtenues. Par la suite nous avons tenté de cloner un gène de RNase HII chez le protozoaire parasite Leishmania mexicana amazonensis. Cette tentative a échoué. Actuellement, très peu d'inhibiteurs de RNases H existent et la stratégie SELEX constitue un bon moyen d'obtenir de tels ligands. Nous avons entrepris une sélection in vitro contre la RNase HII recombinante humaine. A l'issue de la sélection deux aptamères ont retenu notre attention. Le premier, b33, était un bon inhibiteur de la RNase HII avec une IC50 de 120 nM. Cette inhibition était spécifique des RNases HGII eucaryotes. Celui-ci peut se structurer en tige-boucle imparfaite. Le second, b12 n'inhibait que modestement la RNase HII humaine et celui-ci avait la possibilité de former plusieurs structures impliquant des tétrades de G.

  • Titre traduit

    Eukaryotic RNases H : comparative studies on synthetic substrates and identification of selective inhibitory aptamers


  • Résumé

    RNases H are ubiquitous enzymes that hydrolyse the RNA of a DNA/RNA hybrid. They are found in all kingdoms. They participate in the removal of RNA primers of Okazaki fragments. A role in transcription also suspected. RNases H are divided in two classes : class I and class II. RNases HI are nuclear whereasRNases HII are cytoplasmic and mitochondrial. RNases H are also known to be implicated in antisens effects of oligodeoxyribonucleotides. To help in designing new antisens molecules and to possess a new classification criterion, we have analysed the first cuts of these enzymes on various hybrids of 20 nucleotides in length. The tested RNases HI (from bovine and human origin) prefers the 3' end of the RNA engaged in a hybrid whereas RNases HII cut preferentially at 6 and 8 nucleotides from the 5' end of the same RNAs. Moreover informations on mitochondrial localisation of RNases HII has been obtained using this new classification criterion. After this, we have attempted to clone an RNase HII gene from the protozoan Leishmania mexicana amazonensis. This attempt did not succeed. Nowadays, only a few inhibitors of the RNase H activity are known. A good mean to obtain such inhibitors is to use SELEX strategies. We have made an in vitro selection of single stranded DNA aptamers against human recombinant RNase HII. One, b33 inhibited RNaseHII with an IC50 value of 120 nM. This inhibition was specific for eukaryotic RNases HII. B33 could fold into an imperfect stem-loop structure. The second aptamer, b12 poorly inhibited human RNase HII. Moreover several structures could be formed implicating G-quartet formation.

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Informations

  • Détails : 157 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 125-154

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