Etude par imagerie de fluorescence et analyse multiparamétrique de la variabilité de populations de lymphocytes circulants : application à la détection des effets de facteurs exogènes : limites dans l'utilisation du Mag-indol 1 pour la mesure de Mg2+ intracellulaire

par Judith Pesco

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Jean-Marie Salmon.

Soutenue en 2000

à Perpignan .

  • Titre traduit

    Study by videomicrofluorometry and multiparametric analysis of the peripheral blood lymphocytes populations variability : application to the detection of the exogenous factors effects : limits of Mag-Indo 1 use as a intracellular Mg2+ concentration indicator


  • Résumé

    Une analyse multiparamétrique a été entreprise pour caractériser des populations lymphocytaires circulantes, définir la variabilité interindividuelle, et détecter ainsi les signes d'agressions des organismes. Les paramètres morphométriques et biochimiques pris en compte (marquage membranaires, activité des mitochondries, concentration en Mg 2+) ont été mesurés à l'aide de sondes fluorescentes et des techniques de microspectrofluométrie et d'analyse d'images. La mesure du Mg 2+ cytosolique nécessitait d'abord d'optimiser le protocole d'utilisation du Mag-Indo 1. Dans cette optique, une étude menée sur la liaison de cette sonde au Ca 2+ a révélé la similitude des spectres du Mag-Indo 1 lié au Ca 2+ et au Mg 2+, et a permis d'évaluer une constante de dissociation Kd,ca=0,78uM. En conséquence, le Ca 2+ intracellulaire ne pouvait être négligé, d'autant plus que dans des fibroblastes pris comme modèle, le Mag-indo 1 lié à un cation se localisait principalement dans le réticulum endoplasmique. Outre ce résultant empêchant l'évaluation fiable du Mg 2+, l'absence de fluorescence du Mag-indo 1 lié à un cation dans des lymphocytes n'a pas permis de mesurer la concentration en Mg 2+. L'étude des propriétés de ces cellules a alors reposé sur des paramètres mesurés par un triple marquage à la hoechst 33342 (sonde nucléaire), à la rhodamine 123 (sonde mitochondriale), et au rouge Nil (sonde membranaire). Par analyse factorielle discriminante (AFD), dix types de lymphocytes ont été caractérisés et un groupe d'apprentissage représentatif de ces sous-populations a été utilisé ensuite pour mettre en évidence les effets de la conservation en culture, la perturbation des lymphocytes par l'héparine, les modifications de propriétés après activation, et étudier l'effet du tabagisme. Dans ce dernier cas, l'introduction, dans l'AFD, d'autres paramètres concernant les prosomes et les analyses hématologiques des donneurs, a permis de mieux différencier des individus selon le tabagisme et le sexe.


  • Résumé

    A multiparametric analysis was performed in order to caracterize peripheral blood lymphocytes populations, then to determinate the limits of the interpersonal variability, and thus to evidence body perturbations by endogenous or exogenous factors. The measurements of morphometrical and biochemical parameters (membrane staining, mitochondria activity, Mg 2+ concentration) involved fluorescent dyes, microspectrofluometric and numerical image analysis techniques. Using Mag-indo 1 as a Mg 2+ probe, required the optimisation of the measurement protocol. For this purpose, we studied the physico-chemical properties of the dye binding to Ca 2+. We showed that fluorescence spectra of Mag-indo 1 bound to Ca 2+ and bound to Mg 2+ were identical, and determinad a dissociation constant Kd,ca value of 0,78 uM. Consequently, intracellular Ca 2+ could not be neglected, all the more so since Mag-indo 1 bound to cation was mainly localized in endoplasmic recticulum, in fibroblasts taken as example. As well as these results compromising reliable Mg 2+ evaluation, the absence of Mag-indo 1 bound to cation in lymphocytes did not allow Mg 2+ measurements. So, the study of lymphocytes properties has been performed on the basis of parameters measured from a simultaneous staining with hoechst 33342 as nuclear dye, rhodamine 123 as mitochondria dye and Nile red as plama membrane dye. Using discriminant factorial analysis (DAF), ten lymphocytes sub-populations were caracterized, and a sample including these cell types has been used to detect properties modifications according to time of the culture keeping, heparin treatment, cell activation and nicotine addiction. In the latter case, we showed that by adding, into DAF, parameters concerning prosomes and haematological analysis of blood donors, we could differentiate men and women smokers and non smokers

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Informations

  • Détails : 162 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 139-150

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  • Bibliothèque : Université Perpignan Via Domitia. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH 2000 PES
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