L'axe neuromusculaire : accumulation de l'acetylcholinesterase a la synapse et utilisation de la surexpression de l'utrophine par la voie du monoxyde d'azote comme traitement potentiel des dystrophinopathies

par EMMANUEL CHAUBOURT

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de SABINE DE LA PORTE.

Soutenue en 2000

à PARIS 11, ORSAY .

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  • Résumé

    J'ai etudie les mecanismes cellulaires et moleculaires impliques dans l'expression et la distribution de trois molecules du complexe postsynaptique de la jonction neuromusculaire (jnm). D'une part, l'acetylcholinesterase (ache) de la lame basale et le recepteur de l'acetylcholine (achr) de la membrane musculaire et d'autre part, l'utrophine, molecule du cytosquelette sous-membranaire. Expression et localisation de l'ache et des achr dans deux variants de la lignee musculaire de souris c2. L'ache et les achr sont normalement colocalises a la jnm. L'analyse de l'expression et de la localisation de ces deux molecules dans des myotubes de rat traites soit par des serums de myastheniques (ils contiennent des anticorps diriges contre les achr), soit par des anticorps monoclonaux anti-achr, avaient suggere que l'accumulation de l'ache, lors de la formation de la jnm, necessitait la presence prealable des amas d'achr. L'accumulation de ces molecules a la jnm, au cours du developpement, serait sequentielle. J'ai confirme cette hypothese en utilisant une approche plus directe : deux variants de la lignee musculaire de souris c2, qui ne synthetisent pas d'achr (c2 1r) ou qui ne forment pas d'amas d'achr (s27). Sur ces variants, et en comparaison avec la lignee c2 sauvage, l'activite et la distribution de l'ache a ete analysee dans des conditions de monocultures et de cocultures en presence de cellules nerveuses de la moelle epiniere. Lorsque les amas d'achr sont absents, il est impossible d'obtenir la formation d'amas d'ache. Ce travail a ete poursuivi par une etude de l'activite de l'ache qui a revele que l'activite de la lignee c2 1r etait tres augmentee (x4,5), et que celle de la lignee s27 etait tres diminuee (/10), par rapport a la lignee c2 sauvage. Enfin, l'analyse de la distribution des differentes isoformes de l'ache a montre que les 2/3 de l'activite de l'ache dans les myotubes sont intracellulaires et que cette activite est principalement representee par des formes globulaires. Par contre, la tentative d'utiliser la technique antisens pour inhiber directement la synthese des achr musculaires, a necessite une longue mise au point sur notre systeme de culture et a donner des resultats trop variables pour etre retenus. La l-arginine et le no augmentent l'utrophine membranaire. L'utrophine, molecule du cytosquelette sous-membranaire, suscite beaucoup d'interet depuis quelques annees. En effet, elle possede de nombreux points communs avec la dystrophine. L'absence de dystrophine, qui caracterise les myopathies de duchenne (dmd) et de becker (bmd), se traduit par une degenerescence musculaire tres severe, les malades ont une esperance de vie de trente ans. L'utrophine, outre son homologie de sequence et de structure avec la dystrophine, est exprimee chez le ftus sous la membrane des fibres musculaires avant d'etre remplacee par la dystrophine. Deux modeles de souris transgeniques ont ete crees, et ont permis de montrer que l'utrophine avait la capacite de remplacer fonctionnellement la dystrophine. L'utrophine et la dystrophine font parties d'un complexe de proteines et de glycoproteines qui relient la lame basale au cytosquelette, assurant ainsi la stabilite de la membrane musculaire. Parmi les nombreuses molecules de ce complexe, une des rares, avec la caveoline, a avoir une activite enzymatique, est une isoforme de la monoxyde d'azote synthase neuronale (nosn) qui est particulierement accumulee a la jnm, zone ou l'utrophine reste exprimee chez l'adulte sain. C'est cette voie que j'ai privilegiee pour essayer de reactiver l'expression de l'utrophine dans des myotubes en culture et chez des souris saines et dystrophiques. J'ai observe une surexpression de l'utrophine, visualisee par immunofluorescence, dans les myotubes sains et mdx (le modele animal dmd), traites par le substrat de la nos, la l-arginine, par un donneur de no, le sin-1, ou par l'hydroxyuree qui est utilisee pour induire l'expression de l'hemoglobine ftale dans le cas de -globinopathies. La voie de transduction du no semble passer par le gmpc car l'augmentation de l'expression de l'utrophine est inhibee en presence d'odq, un inhibiteur de la guanylate cyclase. Les premiers resultats in vivo indiquent que l'injection quotidienne de l-arginine a des souris saines et mdx permet d'obtenir l'apparition d'utrophine au niveau du sarcolemme chez les souris saines et l'augmentation de la surexpression intrinseque chez les souris mdx. Les experiences qui nous ont permis de reexprimer l'utrophine pourrait etre a l'origine d'un traitement palliatif des dystrophies musculaires de duchenne et de becker, dans l'attente ou en association avec la therapie genique et/ou cellulaire. Le principe du traitement pourrait s'etendre a d'autres pathologies pour lesquelles un gene ftal est susceptible de compenser le defaut d'expression d'un gene adulte, par exemple la drepanocytose et la thalassemie.

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Informations

  • Détails : 200 p.
  • Annexes : 800 ref.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
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  • Cote : TH2014-014690
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