Etude biochimique et moleculaire des antennes collectrices d'energie a chl a/c et fucoxanthine d'algues brunes. Mise au point d'un protocole de transformation genetique de gametophytes de laminaires et de diatomees pour l'etude des connexions pigments-proteines

par ALESSANDRA DE MARTINO

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de Jean-Claude Duval.

Soutenue en 2000

à Paris 6 .

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  • Résumé

    La collecte de l'energie lumineuse chez les organismes photosynthetiques est assuree par des edifices multi-proteiques qui comportent des pigments, appeles antennes. Chez les heterokontophytes, comme les vegetaux verts ces antennes ou light-harvesting complexes (lhc) sont intrinseques a la membrane. Les antennes des algues brunes et des diatomees sont particulierement interessantes car elles presentent des polypeptides dont la structure est proche de celle des antennes a chla/b des vegetaux verts, avec trois helices transmembranaires, bien qu'elles fixent des pigments de nature differente. Ces pigments qui absorbent efficacement les photons bleus-verts, majoritaires en milieu marin, sont la chlorophylle c et la fucoxanthine, un carotenoide particulier. Ces complexes a chla, chlc et fucoxanthine, appeles lhcf, constituent un modele original et encore mal connu d'antennes chlorophylliennes. Cette etude s'est focalisee sur la structure des antennes collectrices d'algues brunes. La premiere partie du travail a consiste a l'etude biochimique et spectrophotometrique des complexes lhcf. Chez laminaria saccharina (laminariales), une etude comparative de trois fractions antennaires lhcf-0, lhcf-i et lhcf-ii a ete entreprise pour caracteriser d'eventuelles categories antennaires chez les algues brunes. Une structure antennaire, fonctionnelle in vitro, appelee lhcfa, avec des caracteristiques polypeptidiques et pigmentaires tres semblables, alimentant aussi bien le psi que le psii, est retrouvee dans toutes les fractions antennaires. Elle est composee de plusieurs polypeptides semblables (pm = 20 kda et de pi = 4,7), fixant chacun 6 chla, 2 chlc et 7 fucoxanthines. La stabilite de ce complexe antennaire permet les etudes biochimiques et biophysiques des associations pigments-proteines. Nos resultats soutiennent l'idee de structures antennaires indifferenciees qui distribueraient efficacement l'energie collectee aux 2 photosystemes. Chez pelvetia canaliculata (fucales), une espece de haut niveau de la zone intertidale, la distribution des pigments du cycle des xanthophylles impliques dans les phenomenes de photoprotection des structures photosynthetiques, a ete recherchee au sein des fractions lhcf-0. Cette etude a montre que les pigments du cycle des xanthophylles sont faiblement associes aux fractions antennaires. La question de l'existence de complexes impliques specifiquement dans les mecanismes de photoprotection reste donc entiere chez les algues brunes. Dans une deuxieme partie, la famille multigenique lhcf codant pour les polypeptides lhcf de l. Saccharina a ete etudiee en comparaison avec 2 autres laminariales : laminaria digitata et macrocystis pyrifera. En accord avec la biochimie, cette etude a montre que les proteines lhcf des trois especes de laminariales sont codees par des genes tres proches. Nous avons trouve de fortes homologies dans les regions regulatrices (utr) de certains genes appartenant a 3 especes de laminariales differentes, suggerant des mecanismes d'expression proches. Par ailleurs, sept des huit sites fixateurs de chl identifies dans les antennes a chla/b des vegetaux superieurs sont conserves sur toutes les sequences lhcf des 3 especes de laminariales, et 6 d'entre eux pourraient fixer les 6 chla identifiees dans les complexes lhcfa. Si les alignements de sequences permettent de proposer des sites de fixation pour la chla, la localisation des molecules de chlc et de fucoxanthine dans les complexes antennaires d'algues brunes reste a elucider. L'objectif de la troisieme partie du travail etait de developper un modele d'expression in vivo des proteines lhcf de laminaria saccharina, dans des cellules a chla/c et fucoxanthine, afin de pouvoir analyser par mutagenese dirigee les sites de fixation des pigments sur les proteines. La methode de transformation utilisee est le bombardement des cellules hotes par des microparticules sur lesquelles l'adn etranger est precipite, on parle de transformation par biolistique. Deux strategies ont ete envisagees : transformer les gametophytes de laminaria saccharina et laminaria digitata ou la diatomee phaeodactylum tricornutum. Cette etude constitue la premiere approche de transformation genetique de gametophytes de laminaires. Le vecteur de transformation choisi, conferant aux cellules la resistance a un antibiotique, n'a pas permis d'obtenir de transformants stables. L'hypothese la plus probable est que le genome nucleaire des laminaires comporte un biais important dans l'usage des codons, qui ne facilite pas l'expression de proteines etrangeres. Une des solutions serait de modifier les sequences en les adaptant aux particularites du genome nucleaire.

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Informations

  • Détails : 341 p.
  • Annexes : 257 ref.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 2000
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