Caracterisation biochimique et structurale d'une -glycosidase de thermus thermophilus surexprimee chez e. Coli

• Auteur / Autrice : LAURENT FOURAGE
• Direction : Bernard Colas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Nantes

Résumé

La synthese enzymatique de neoglycoconjugues necessite la recherche de sources originales d'enzymes ou la modification des biocatalyseurs deja existant. Une nouvelle glycosidase (ttgly), issue d'un microorganisme thermophile thermus thermophilus, a ete clonee et surexprimee chez e. Coli. La thermostabilite importante de l'enzyme permet sa purification en une seule etape chromatographique. C'est une enzyme monomerique de masse moleculaire egale a 49 kd qui agit selon un mecanisme de retention de configuration. Ttgly a un ph optimum de 7,0, son activite est maximale a 88\c et elle garde 100% de son activite pendant plusieurs heures a 70\c. L'enzyme possede une large specificite vis a vis des residus glycosyle, et elle accepte des oligosaccharides (cellopentaose, laminarine). La regioselectivite de l'enzyme est dans l'ordre : -1-3>-1-2>-1-4>-1-6. Sa thermostabilite importante nous a permis d'etudier son comportement cinetique dans une large gamme de temperature et de mettre en evidence des cinetiques non-michaeliennes incluant a la fois des inhibitions a basse temperature et des activations a haute temperature. L'enzyme catalyse des reactions de transglycosylation (sur le substrat lui-meme ou sur d'autres accepteurs tels le glucose ou des amino acides hydroxyles) avec une tres grande efficacite. L'obtention de la structure tridimensionnelle de l'enzyme, par homologie de sequence, et le docking des substrats dans le site actif a permis d'expliquer en partie la specificite de substrat de l'enzyme. Les etudes de mutagenese dirigee, faite sur ttgly nous ont permis d'une part, de construire la premiere glycosynthase thermophile (glycosidase capable de synthetiser des oligosaccharides mais ne pouvant pas les hydrolyser ulterieurement) et permis d'autre part de montrer qu'il etait possible de modifier la specificite de l'enzyme.