La proteine regulatrice argr de bacteries hyperthermophiles du genre thermotoga : clonage, thermostabilite et interactions avec l'adn

par DILIANA DIMOVA

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Sciences médicales

Sous la direction de Vehary Sakanyan.

Soutenue en 2000

à Nantes .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Afin d'etudier la regulation transcriptionnelle chez les micro-organismes hyperthermophiles, nous avons choisi comme modele les genes du metabolisme de l'arginine chez des representants du genre thermotoga. Le gene argr a ete clone a partir des bacteries t. Neapolitana et t. Maritima. D'apres des experiences d'exclusion-diffusion, les monomeres de la proteine argr (17. 2 kda) s'assemblent en trimeres en absence d'arginine. Les trimeres identiques peuvent eux-memes former des hexameres soit en presence d'arginine, soit a des concentrations elevees en proteine. L'analyse par dichroisme circulaire de la proteine argr revele qu'elle possede une temperature de denaturation d'environ 103\c et qu'elle est tres resistante a l'action de l'uree. Un operateur putatif nomme argr 0, presentant une sequence proche de celle des operateurs arg identifies chez d'autres bacteries, a ete mis en evidence en amont du gene argr de t. Neapolitana. Des experiences de retardement sur gel ont ete realisees pour examiner les interactions de la proteine argr avec argr 0. La proteine est capable de se fixer sur cette cible meme apres 24 h de traitement a 95\c. En consequence, nous avons developpe une methode d'identification de la region d'interaction de l'adn avec la proteine argr qui a permis de preciser la position de l'operateur argr 0. La fixation de la proteine argr augmente la temperature de denaturation de l'adn cible de 15\c a des concentrations faibles en sels. La proteine montre une affinite importante pour l'operateur argr 0 dans une gamme de temperatures allant de 4\c a 80\c et cette affinite est plus forte en absence d'arginine qu'en sa presence. Par contre, vis-a-vis de l'operateur argg 0 1, situe en amont des genes de la voie de biosynthese de l'arginine, argghcjbd de t. Maritima, l'affinite de la proteine argr est plus elevee en presence d'arginine qu'en son absence. La proteine argr du genre thermotoga se comporte comme un surrepresseur, car elle empeche la croissance des cellules hotes d'escherichia coli sur milieu minimum meme en presence d'arginine. Dans le meme contexte, la proteine est capable de fixer l'operateur heterologue argc 0 de bacillus stearothermophilus. Elle reprime faiblement la transcription des genes-rapporteurs a partir du promoteur pargc de b. Stearothermophilus dans les cellules d'e. Coli et dans le systeme in vitro de transcription-traduction couple d'e. Coli. Cette repression est plus accentuee pour le mutant ser107gln d'argr qui possede une dependance importante vis-a-vis de l'arginine. Nos resultats montrent donc, que grace a sa capacite a se fixer de facon arginine-dependante ou arginine-independante sur des operateurs differents, la proteine argr peut jouer un role global dans la regulation de la transcription des genes chez les bacteries hyperthermophiles.


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