Traduction des ARNm du placenta humain dans le système acellulaire du germe de blé : optimisation par des molécules oxydantes, identification des protéines, régulation au cours du stress oxydant, rôle du bore

par Michel Dzondo Gadet

Thèse de doctorat en Médecine

Sous la direction de Pierre Nabet.

Soutenue en 2000

à Nancy 1 .


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  • Résumé

    Thèse de doctorat en Génie biologique et médicale. Les travaux antérieurs réalisés au laboratoire ont montré qu'un excès d'oxygène ou un système générateur de radicaux libres (H[indice 2]O[indice 2]) augmentaient l'efficacité de la traduction des ARN[indice m] placentaires humains dans le système acellulaire de germe de blé. Nous confirmons ces résultats avec le germe de blé de Minneapolis et celui de Promega exempt d'ARN[indice m] résiduels. Nous montrons également que l'oxygène et H[indice 2]O[indice 2] stimulent de 6 à 30 fois la traduction dans un autre système : le lysat de réticulocytes de lapin. Quelque soit le traceur utilisé [ [exposant 35]S]-cystéine, [[exposant 3]H]-[FPKLY]. [[exposant 14]C]-proline, l"oxygène et H[indice 2]O[indice 2] stimulent la traduction de façon significative. La séparation des produits de traduction par RP-HPLC ou le dosage des protéines totales par BCA confirment ces résultats. Parmi les protéines synthétisées, nous avons identifié par western-blot et dosage radioimmunologique des hsp (hsp 90, hsp 70), l'hCG, l'AFP, l'hPL, l'IGF I, le VEGF et le TGF[bêta]. La synthèse de ces deux derniers facteurs de croissance inhibée par H[indice 2]O[indice 2] est stimulée par une solution d'acide borique 10mM. Nous avons montré que le taux de phosphorylation mesuré par l'incorporation de [gamma][[exposant 33p]]-ATP était élevé en présence des radicaux libres oxygénés. Nous avons constaté que deux inihibiteurs de la PKC, la calphostine C(250 nM) et la bisindolylmaléimide (0,1 nM) inhibent différemment la synthèse des protéines tant dans le germe de blé que dans le lysat de réticulocytes de lapin en présence des RLO. Nous en avons conclu que O[indice 2] et H[indice 2]O[indice 2] n'avaient pas les mêmes mécanismes d'action et que leurs activités pouvaient passer par des modifications de l'ARN[indice m] lui-même et par l'activation des isoformes de la PKC. EN outre la traduction est sensible au NADPH et sous RLO elle est sensible au cycloheximide (<10[micro]M), au m-7-GDP(<0,1 [micro]M), aux inhibiteurs des P450 (kétoconazole et au proafiden). Nous en déduisons que l'action des RLO se fait de façon majeure sur l'étape de l'initiation et ultérieurement sur les membranes du réticulum endoplasmique. Enfin le bore stimule la transcription dans les noyaux du placenta humain et la traduction des ARNm qui en résultent. Le bore stimule également la phosphorylation des protéines. L'ensemble de nos résultats montre que le stress peut servir à optimiser un système de traduction in vitro.

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  • Détails : 1 vol. (356 p.)

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