Etude d'endoxylanases recombinantes hybrides à étiquette poly-histidine : construction par fusion de gènes et comparaison des propriétés des enzymes libres et immobilisées sur support métal-chélate

par Laurent Mesta

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Pierre Coulet.

Soutenue en 2000

à Lyon 1 .

Le président du jury était Pierre Coulet.


  • Résumé

    L'existence de domaines catalytiques répétés et la plurifonctionnalité des hydrolases microbiennes confèrent à ces enzymes une capacité exceptionnelle dans la dégradation des polysaccharides végétaux. La combinaison de domaines actifs d'enzymes cellulolytiques (endoxylanase, β-xylosidase) de champignons anaérobies du rumen a permis de créer des protéines présentant de nouvelles caractéristiques. La construction d'enzymes recombinantes multifonctionnelles est réalisable par les techniques de fusion de gènes ou de fragments de gènes. XYN3 et XYN4 sont deux xylanases bifonctionnelles ayant pour origine le champignon anaérobie du rumen Neocallimastix frontalis. Une endoxylanase chimérique XYN3A4 a été construite à partir de la fusion d'un domaine catalytique de XYN3 avec un autre domaine catalytique XYN4. Après clonage des ADNc xyn3, xyn3A, xyn4 et xyn3A4 dans un vecteur plasmidique permettant l'obtention d'un "tag" (His)6 en position C-terminale, les endoxylanases recombinantes ont été produites chez Escherichia coli. En solution, la xylanase chimère XYN3A4 possède une meilleure affinité pour le xylane et une Vmax plus importante que celle de ses éléments constitutifs XYN3A et XYN4. L'affinité pour les ions métalliques a permis d'immobiliser ces protéines recombinantes afin d'examiner les effets de la fusion de gènes et de l'immobilisation sur les propriétés de chaque xylanase recombinante. L'immobilisation sur IDA-NiII a montré la meilleure capacité à réunir à la fois un bon rendement de fixation et une efficacité de couplage importante. L'analyse par HPLC des produits d'hydrolyse du xylane a montré dans le cas de l'enzyme libre, que la fusion de gène ne modifiait pas le profils obtenus par rapport à XYN3A notamment et que les produits terminaux (X2 et X3) ainsi que les produits substitués demeuraient identiques. Cependant, quand l'enzyme chimère est immobilisée, on a observé l'apparition d'un nouveau produit qui n'apparaît pas avec XYN3 et XYN3A.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (158 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 137-158

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