Expression et compartimentation du répresseur glucose CRE1 du champignon phytopathogène Sclerotinia sclerotiorum

par Géraldine Vautard-Mey

Thèse de doctorat en Sciences

Sous la direction de Michel Fèvre.

Soutenue en 2000

à Lyon 1 .

Le président du jury était Michel Fèvre.


  • Résumé

    Ce travail traite de la caractérisation des mécanismes gouvernant la synthèse et l'activité du régulateur transcriptionnel CRE1 codant chez le champignon phytopathogène sclerotinia sclerotiorum. Afin d'isoler le gène CRE1 codant pour le répresseur glucose de S. Sclérotiorum, un fragment d'ADN génomique a été amplifié à l'aide d'oligonucléotides dégénérés et utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADN génomique. Le gène CRE1 ainsi isolé a été cloné et séquencé. Des expériences de complémentation de mutants déficients ont montré que CRE1 est l'équivalent fonctionnel de CREA d'A. Nidulans mais ne complémente pas les déficiences MIG1 et MIG2 chez S. Cerevisiae. Les analyses en Northern Blot ont montré que le taux de transcrits CRE1 varie en fonction de la source carbonée et du PH extracellulaire. L'effet PH apparaît indépendant de Pacc, seul régulateur transcriptionnel impliqué dans la régulation PH, identifié chez les champignons filamenteux. La protéine de fusion GST::CRE1 purifiée a été utilisée pour produire des anticorps polyclonaux. Les analyses en SDS-PAGE et Western Blot ont mis en évidence l'induction de la synthèse de CRE1 en présence de glucose et sa stabilité après transfert dans des conditions non inductrices (milieu pectine), suggérant l'existence de régulations post-traductionnelles. Les expériences de fractionnement cellulaire et les analyses en Western Blot ont montré la localisation nucléaire de CRE1 en présence de glucose et son export dans la cytosol après transfert en milieu pectine. L'observation microscopique de transformants d'A. Nidulans exprimant la fusion GFP::CRE1 a suggéré que la régulation de la compartimentation du répresseur glucosé est conservée chez les ascomycètes filamenteux. Cinq sites potentiels de phosphorylation par les sérine-thréonine kinases de type AMPK ont été identifiés dans la séquence peptidique déduite de CRE1. Les sérines phosphorylables ont été remplacées par des alanines dans la fusion GFP::CRE1 par mutagén-se dirigée. L'une des mutations abolit l'activité répresseur de la protéine de fusion mais n'affecte pas la régulation de sa compartimentation. L'activité du répresseur CRE1 pourrait par conséquent être contrôlée indépendamment par les changements de localisation subcellulaire et de phosphorylation de la protéine.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (210 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 197-210

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  • Bibliothèque : Université Claude Bernard (Villeurbanne, Rhône). Service commun de la documentation. BU Sciences.
  • Disponible pour le PEB
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