Caracterisation biochimique et moleculaire de la para-hydroxyphenyle pyruvate dioxygenase des vegetaux superieurs : localisation sub-cellulaire et cinetique d'inhibition par le dicetonitrile de l'isoxaflutole

par ISABELLE GARCIA

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de MICHEL MATRINGE.

Soutenue en 2000

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La p-hydroxyphenyle pyruvate dioxygenase (hppd) catalyse la formation d'homogentisate a partir de p-hydroxyphenyle pyruvate (hpp) et d'oxygene moleculaire. Chez les organismes photosynthetiques, cette enzyme est impliquee dans deux voies metabolique distinctes, le catabolisme de la tyrosine et la biosynthese des prenylquinones. Afin de determiner si cette dualite metabolique implique l'existence de deux isoformes de l'hppd, localisees dans des compartiments sub-cellulaires distincs, nous avons, dans une premiere partie, entrepris l'etude de la localisation sub-cellulaire de l'hppd chez les vegetaux. Que ce soit par mesure directe de l'activite hppd dans des fractions enrichies en proteines des differents compartiments cellulaires, preparees a partir de protoplastes de cellules de carotte ou par immunodetection de l'hppd d'a. Thaliana surproduite dans le tabac, les resultats obtenus demontrent l'existence, chez les plantes etudiees, d'une seule isoforme de l'hppd, localisee dans le cytosol et certainement impliquee dans les deux voies metaboliques. D'autre part, l'hppd ayant recemment ete definie comme la cible moleculaire de nouvelles familles d'herbicides a effet de blanchiment, nous avons dans une seconde partie entrepris la caracterisation biochimique de l'hppd de carotte. Grace a la surproduction et a la purification a homogeneite, pour la premiere fois chez les plantes, de l'hppd de carotte, nous avons pu precisement determiner les parametres cinetiques de cette enzyme et realiser une etude fine de son inhibition par le dicetonitrile de l'isoxaflutole (dkn), un inhibiteur appartenant a la famille des benzoyl isoxazoles. Le dkn se comporte comme un inhibiteur quasi irreversible de l'hppd, a fixation lente et competitive vis-a-vis du substrat, l'hpp. Il presente d'autre part la particularite d'une reactivite demi-site c'est-a-dire, qu'une seule molecule de dkn se fixe par dimere d'hppd et est suffisante pour totalement inhiber l'enzyme.

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  • Détails : 143 p.
  • Annexes : 146 ref.

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