Clonage d'un gene codant une -glucosidase issu d'une archaebacterie hyperthermophile thermococcus hydrothermalis. Etude de l'expression chez saccharomyces cerevisiae et escherichia coli

par ARNAUD GALICHET

Thèse de doctorat en SCIENCES BIOLOGIQUES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES. PSYCHOLOGIE

Sous la direction de Abdel Belarbi et de Francis Duchiron.

Soutenue en 1999

à Reims .

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  • Résumé

    La souche thermococcus hydrothermalis possede plusieurs enzymes amylolytiques capables de travailler a haute temperature. L'obtention de ces enzymes directement a partir de la souche archaebacterienne n'est pas evidente. Nous avons donc cherche a cloner le gene codant pour une de ces enzymes, l'-glucosidase, chez un hote mesophile, saccharomyces cerevisiae. Pour cela, nous avons utilise un mutant de levure dont le gene codant pour la maltase a ete interrompu et une approche de complementation fonctionnelle par une banque d'expression d'adn genomique de la souche t. Hydrothermalis. Nous avons isole le plasmide p41006f, possedant la capacite de permettre la complementation du mutant tcy70. Le fragment insere dans ce plasmide contient une seule phase ouverte de lecture codant pour une proteine de 242 acides amines. En amont du codon atg, nous avons trouve les trois sequences promotrices impliquees dans la transcription et la traduction. Elles sont similaires a celles trouvees chez la plupart des genes deja clones chez les archaebacteries. L'analyse des sequences terminatrices revele egalement les motifs decrits, chez les archaebacteries, comme signaux de terminaison de la transcription. La comparaison des sequences effectuees contre les banques de donnees montre que cette sequence proteique presente une homologie avec une proteine de fonction inconnue de pyrococcus horikoshii. Par hybridation en southern blot, nous avons pu voir qu'une sequence nucleotidique proche de celle de notre gene est presente dans le genome des souches archaebacteriennes t. Celer, t. Fumicolans et p. Abyssi. Le clonage de cette sequence nucleotidique dans un plasmide d'expression de levure a permis la complementation de la souche de levure deficiente pour le gene de la maltase. Le gene codant pour cette enzyme -glucosidase a ete exprime chez s. Cerevisiae et e. Coli. L'enzyme recombinante produite chez la levure a ete utilisee afin de determiner certaines proprietes physico-chimiques. Le ph optimal est de 5. 5. Cette enzyme est active a partir de 30\c et jusqu'a 110\c. Elle hydrolyse le maltose, le maltotriose et l'amidon, en liberant du glucose, mais pas l'-pnpg. Lors de cette etude, la souche de levure transformee par le plasmide p41006f a montre une coloration rose des cellules. L'etude de ce phenotype a ete suivie par spectroscopie ftir et a montre des modifications au niveau des polysaccharides parietaux.


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  • Détails : 172 p.
  • Annexes : 199 ref.

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