Synthese et secretion des proteines heterologues chez la levure

par WEIGUO BAO

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Hiroshi Fukuhara.

Soutenue en 1999

à PARIS 11, ORSAY .

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  • Résumé

    Kluyveromyces lactis est souvent choisie comme hote pour la synthese et la secretion de proteines recombinantes, chez le levure. La plupart des premieres etudes etaient axees sur la construction de cassettes portant des genes avec des promoteurs forts ou regules pour obtenir une transcription maximale. Alors qu'un fort niveau de transcription etait atteint dans certains cas, la secretion des proteines n'etait pas proportionnellement activee. Il etait donc suggere qu'une forte transcription n'assurait pas la secretion en grande quantite de la proteine. D'autres etapes limitantes sont aussi impliquees dans differents aspects de la physiologie cellulaire. Dans le but d'assurer la secretion de proteines heterologues, le remodelage de la physiologie cellulaire est apparu comme une nouvelle strategie. Le travail presente participe cette strategie chez k. Lactis en deux points : (i) entre les processus post-translationnels et ceux de la secretion, ceux du repliement des proteines sont specialement consideres comme les obstacles les plus probables pour la secretion de certaines proteines recombinantes. Une proteine disulfure isomerase (pdi) a ete decrite comme foldase pour initier le repliement des proteines en catalysant la formation de ponts disulfures corrects lorsque les proteines nouvellement synthetisees sont transferees dans le reticulum endoplasmique. (ii) d'un autre cote, l'expression des proteines etrangeres interfere avec la physiologie cellulaire normale et celles-ci peuvent mobiliser des reponses au stress qui peuvent alors creer de nouveaux obstacles pour la secretion. Le gene de la polyubiquitine est connu pour etre active en condition de stress. Pour ces raisons, les genes codant pour la pdi et la polyubiquitine ont ete choisis pour notre etude. Les deux genes de la proteine disulfure isomerase et les trois de la polyubiquitine de k. Lactis ont ete tous isoles et sont caracterises dans ce travail. Chez k. Lactis, les genes klpdi1 et klmpd1 codent respectivement pour une proteine disulfure isomerase et son homologue structural. Les deux produits contiennent la signature du site actif relatif a la thioredoxine. Leurs c terminaux possedent un nouveau type de signal de retention dans le reticulum endoplasmique, qdel. Une simple copie de klpdi1 est capable de complementer le defaut de croissance du mutant pdil de saccharomyces cerevisiae. Klmpd1 sur un vecteur multicopie supprime partiellement les mutations klpdi1 et pdi1. La mutation nulle de klpdi1 est letale. Le disruptant klmpd1 est viable mais il montre une sensibilite accrue aux fortes temperatures. Plusieurs motifs de reponses aux stress sont presents dans la sequence en amont de klmpd1 mais pas pour klpdi1 alors que le contraire a ete remarque chez les genes homologues de s. Cerevisiae. La viabilite des mutants klmpd1 n'est pas affectee par la carence en carbone ou azote. Pour l'ubiquitine, trois genes ont ete trouves chez k. Lactis, klubi1, klubi3, klubi4, alors que chez s. Cerevisiae ils sont quatre ubi1, 2, 3 et 4. La duplication ubi1/ubi2 n'est donc pas presente chez k. Lactis. Les caracteristiques structuralles generales des genes de l'ubiquitine sont tres similaires chez les deux especes (presence d'un intron dans klubi1, fusion avec des genes de proteines ribosomales dans klubi1 et klubi3 absence de sequences spacer entre les repetitions de la polyubiquitine dans klubi4). Nous avons trouve que (i) la disruption de klubi1 etait letale (chez s. Cerevisiae la double deletion ubi1/ubi2 est letale). (ii) klubi3 est egalement essentiel pour la croissance (iii) la deletion de klubi4 conduit a une augmentation de la sensibilite aux fortes temperatures, comme la mutation ubi4 chez s. Cerevisiae mais contrairement a ce dernier, le mutant klubi4 n'est pas sensible aux carences en azote et carbone. Pour mieux controler la secretion chez k. Lactis, nous avons poursuivit l'etude des effets de l'expression des genes de la pdi et de la polyubiquitine sur la secretion de deux proteines heterologues. Les souches hp101 et hp108 (surexprimant pdi) et les souches hu415 et hu422 (surexprimant la polyubiquitine) ont ete construite par integration chromosomique d'une copie supplementaire de klpdi1 ou klubi4 soit avec leurs propres promoteurs soit sous controle du promoteur pgk de s. Cerevisiae. Cette seconde copie etant placee en tandem avec le gene resident. Les proteines de mammiferes sont en general difficiles a produire dans des microorganismes. La secretion de deux proteines humaines tres differentes a ete etudiee : celle de la serum albumine humaine (hsa), celle de l'interleukine-1 (il-1). L'hsa est une grosse proteine avec beaucoup de ponts disulfures. L'il-1 est une petite proteine avec un site potentiel de glycosylation. Les resultats montrent que la duplication du gene klpdi1 augmente la secretion de l'hsa 15 fois. La duplication du gene de la polyubiquitine augmente aussi le taux de secretion de l'hsa. Ces duplications n'ont que de faibles effets sur la secretion de l'il-1.

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  • Détails : 171 p.
  • Annexes : 105 ref.

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  • Cote : TH2014-014410
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