Le flavocytochrome b 2 : un modele d'etude d'interactions proteine-proteine. etude cinetique et immunochimique de l'interaction du domaine cytochromique avec ses partenaires : la flavodeshydrogenase et le cytochrome c.

par MARTINE MAYER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de CHANTAL CAPEILLERE BLANDIN.

Soutenue en 1999

à Paris 11 .

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  • Résumé

    Le flavocytochrome b 2 (flb 2) est un enzyme bifonctionnel comportant deux groupements prosthetiques, un flavine mononucleotide et un heme de type b 2, situes dans deux domaines de repliement distincts, la flavodeshydrogenase (fdh) et le noyau b 2. Il catalyse l'oxydation du lactate en pyruvate : les deux electrons provenant du substrat reduisent la flavine qui se reoxyde en les transferant successivement a l'heme b 2, intramoleculairement. Le cycle catalytique est conclu par la reduction du cytochrome c, accepteur physiologique du flb 2. Cet enzyme est maintenant bien caracterise et dans ce travail nous l'avons utilise comme un modele a l'etude d'interactions proteine-proteine. En menant une etude cinetique approfondie de l'enzyme sauvage et du variant y143f dans des conditions de concentration en substrat et de force ionique elevees, nous avons montre que l'interaction intramoleculaire entre les domaines a flavine et a heme necessitait la formation d'une bonne interface et que le domaine cytochromique possedait une certaine mobilite au sein du tetramere. Cette conclusion a ete confortee par l'etude des proprietes d'un anticorps monoclonal qui inhibe le transfert d'electron entre la flavine et l'heme. En utilisant le test elisa et le biacore, nous avons montre que la zone d'interaction de cet anticorps comprend outre les residus glu63 et asn69 les propionates de l'heme, normalement enfouis dans le complexe. Le noyau b 2 doit donc necessairement s'ecarter de la fdh au cours du cycle catalytique. Enfin, nous avons utilise le biacore et des variants du flb 2 pour tenter de localiser le site d'interaction du cytochrome c sur la molecule de flb 2. Le complexe est stable aux faibles forces ioniques mais dans ces conditions le signal non-specifique avec la surface de mesure est tres fort et les mesures au biacore difficiles. Les residus glu63 et asp72 semblent participer a l'interaction et nous esperons optimiser les conditions operatoires afin de confirmer ces resultats.


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Informations

  • Détails : 304 p.
  • Annexes : 194 ref.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-014213
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