Analyse mutationelle de la reaction de deshydrohalogenation catalysee par le flavocytochrome b 2 (l-lactate deshydrogenase) implications mecanistiques

par SABRINA BODEVIN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Florence Lederer.

Soutenue en 1999

à PARIS 11, ORSAY .

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  • Résumé

    Le travail expose dans cette these, s'interesse au mecanisme employe par le flavocytochrome b 2 pour eliminer l'h- du l-lactate lors de sa reduction en pyruvate. Pour cet enzyme les arguments les plus convainquants en faveur d'un mecanisme par carbanion sont bases sur sa capacite a catalyser une reaction de deshalogenation. Cependant le l-lactate peut etre modelise au site actif dans une orientation compatible avec un mecanisme par transfert d'hydrure, permettant encore a la reaction de deshalogenation d'avoir lieu. De plus, l'elucidation de la structure cristallographique de la d-amino acide oxydase favorise un mecanisme par transfert d'hydrure. Or cet enzyme catalyse une reaction de deshalogenation. Ces deux observations impliquent de reevaluer le poids a accorder a la reaction de deshalogenation en tant que sonde mecanistique. On a cherche les conditions experimentales a appliquer sur l'enzyme sauvage intact pour detecter cette reaction. Differentes techniques experimentales ont ete testees : des dosages spectrophotometriques en discontinu, des separations par chromatographie a basse et haute pression, et l'utilisation de 1 4c. Cependant, aucune de ces methodes n'a permis de detecter cette reaction de deshalogenation. Or, on sait qu'elle est catalysee par une forme proteolysee de l'enzyme sauvage, l'enzyme de morton, moins actif, et par trois mutants lents intacts. On a entrepris une etude cinetique comparative de la reduction du bromopyruvate et de sa deshalogenation, dans des conditions de transhydrogenation, entre des enzymes intacts rapides, l'enzyme sauvage et le mutant y143f, et des mutants lents intacts : y254l, y254f, d282n et r289k. Ces experiences ont permis d'identifier des enzymes capables d'eliminer le brome avec des degres d'efficacite varies. C'est cette particularite, associee a la mesure de l'effet isotopique du deuterium sur la reaction de transhydrogenation, qui fourniront des resultats appuyant fortement la these du mecanisme par carbanion.


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Informations

  • Détails : 216 p.
  • Annexes : 141 ref.

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-014195
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